低强度脉冲电磁场对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的影响

摘要

20 世纪70 年代以来，脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs）作为一种非侵入性治疗方法被用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病。电磁场能促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，并能改善股骨的骨密度和生物力学特性。但是电磁场对骨的作用机理还不是很清楚，电磁场的频率、场强、作用时间以及脉宽波形等对治疗效果也有不同程度的影响。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是存在于骨髓基质系统中的一种组织干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，一定的诱导条件下可分化为成骨细胞。而且成体干细胞具有注入体内后的趋化性特征，较明显的集中到受损部位，到达受损伤部位后，在局部微环境的诱导下，成体干细胞发生明显的诱导分化，使成体干细胞向损伤组织修复所急需的组织细胞分化，从而促进损伤组织的修复。这对骨科疾病的自体细胞治疗甚至异体细胞的治疗提供了可能性。 本课题主要研究低强度PEMFs 对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(ratmesenchymal stem cells, rMSCs) 增殖及向成骨细胞分化的影响。应用MTT法、ALP 测定、四环素荧光标记、钙结节染色法测定MSCs 增殖及向成骨细胞分化后的体外骨形成情况。初步探讨了频率和强度对rMSCs 增殖和成骨分化的影响。为临床应用PEMFs 治疗骨折、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病提供了新的思路与方法。 主要工作概括如下： 1、rMSCs 的原代培养 目的：探讨rMSCs 简单有效的体外原代培养方法。 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，差速黏附法进行纯化，绘制原代及生长良好的第3 代细胞的生长曲线，进行PAS-过碘酸雪夫氏染色、油红-O 染色和碱性磷酸酶（ALP）染色。 结果：细胞形态良好，具有MSCs 外观，生长曲线呈典型的S 型，染色结果均为阴性，提示细胞未分泌肝糖元，未向脂肪细胞及成骨细胞方向分化。 结论：实验采用的方法可以获得一定量的rMSCs，方法简单可行，为进一步实验提供了物质基础。 2、PEMFs 对rMSCs 增殖的影响 目的：探讨不同频率，不同磁场强度的PEMFs对rMSCs的影响。 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对生长良好的第3 代细胞进行15Hz ，0.2mT；15Hz ，0.4mT；15Hz ，0.8mT；1Hz，0.2mT； 1Hz，0.4mT； 1Hz，0.8mT的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，流式细胞仪法测定细胞周期变化。 结果：rMSCs经PEMFs刺激5d（1 次/1d，每次3h）后，各实验组细胞增殖水平和（S+G2/M）期细胞数量均有不同程度提高，差异有统计学意义（P<0.05）。 其中MTT水平以1Hz，0.4mT组变化最为明显（3d，0.323±0.051；5d，0.714±0.058），和对照组相比（3d，0.246±0.044；5d，0.487±0.064），差异具统计学意义（P<0.01）；细胞周期变化也以1Hz，0.4mT组变化最为明显（G0/G1：75.3±0.17，S：8.5±0.12，G2/M：16.4±0.20，PI：24.9），相对于对照组（G0/G1：83.3±0.33，S：7.0±0.29，G2/M：9.8±0.23，PI：16.8），差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论：rMSCs经PEMFs场刺激后，能促进体外培养该细胞的增殖水平，磁场参数对实验结果有影响，以1Hz，0.4mT的PEMFs效果最佳。 3、PEMFs 对rMSCs 成骨分化的影响 目的：探讨PEMFs 刺激对rMSCs 向成骨细胞分化的影响。 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，经差速黏附法筛选，对生长良好的第3 代细胞进行频率1Hz 、磁感应强度0.4mT 的PEMFs 刺激，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色。 结果：rMSCs 经PEMFs 刺激（1 次/1d，每次3h）后，实验组碱性磷酸酶水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性。 结论：推测PEMFs 能影响rMSCs向成骨细胞的分化。