甲基叔丁基醚（MTBE）对大鼠学习记忆能力影响及其机制的初步研究

摘要

研究目的 甲基叔丁基醚(Methyl Tert-Butyl Ether，MTBE)是一种新型的汽油添加剂，主要用来增加汽油辛烷值，提高汽油燃烧效率，减少汽车尾气中一氧化碳等有害物质的排放，并代替四乙基铅用作汽油防爆剂。从1992年冬季开始，美国市场上已有大约30％的汽油含MTBE（高达15％），我国目前有31家炼油厂建有MTBE生产装置，已开工的企业16家。随着无铅汽油的推广，MTBE在我国的大规模生产和使用已是必然。由于汽油泄露，美国的一些饮用水源中已检测到MTBE的存在。鉴于空气、水和土壤中MTBE的存在，开展MTBE无铅汽油的毒性研究，对保护使用者的身体健康及未来环境污染的治理都具有深远的意义。 实验研究发现MTBE对神经系统有较高的亲和力及损伤作用；调查研究发现，在使用含MTBE的无铅汽油后，一些地区的居民出现散在的健康主诉包括头痛、头晕、恶心、耳鸣、疲劳、记忆力减退、睡眠甚至认知障碍等神经系统症状。目前对MTBE损伤中枢神经系统（CNS）的机制尚不清楚，对MTBE的生物危害仍无可靠的评价依据和方法，因此研究MTBE损伤CNS的生物效应，阐明MTBE损伤CNS的可能作用机制，是目前亟需解决的重要问题。 学习记忆功能作为脑的高级功能，是非常复杂和精细的神经活动，是评价中枢神经系统功能的重要内容。从对学习记忆功能影响的角度探讨MTBE对中枢神经系统的损伤及其机制，可以深入的了解MTBE对CNS的毒性机理，客观评价其毒性作用，为有效预防MTBE神经毒性作用提供科学依据。 实验方法 利用雄性SD 大鼠建立动物染毒模型，从灌胃染毒、呼吸道吸入染毒到脑室注射染毒中寻找相对合理及实用的染毒方法，最终确立以侧脑室注射建立MTBE 影响学习记忆的动物模型，利用Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆能力的变化；尼氏染色观察MTBE 对大鼠海马神经元形态结构的影响； RT-PCR 法检测海马中GABAARα1 及NMDAR2A&2B 转录水平的变化；免疫组织化学法检测海马GABAAα1 及NMDAR2A&2B 蛋白表达变化； Western blot 检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号转导通路中一些蛋白分子及其磷酸化水平变化；TUNEL 染色观察大鼠海马神经元的凋亡。 实验结果 1、从灌胃染毒后第6 天起染毒组大鼠体重较对照组明显下降，且体重增长率随时间延长而逐渐降低；Morris 水迷宫实验结果显示：灌胃染毒MTBE 对大鼠学习记忆能力未产生明显影响；脑片尼氏染色显示染毒组海马CA1 区尼氏小体较对照组排列紊乱，空泡增多。 2、呼吸道及灌胃染毒后利用气相色谱在脑脊液中可检测到MTBE 及其代谢产物的存在。 3、侧脑室注射MTBE 可以使大鼠的学习能力下降，记忆时间延长。空间定位能力有所下降，记忆提呈的反应时间增加。 3.1 尼氏染色发现大鼠海马部位尼氏小体排列紊乱，结构变形，空泡形成； RT-PCR、免疫组织化学结果显示：不同剂量MTBE 染毒组海马GABAARα1mRNA 及蛋白水平较对照组逐渐增高，NMDAR2A mRNA 及蛋白表达水平较对照组逐渐降低；MTBE 作用不同时间结果显示：大鼠海马GABAARα1mRNA 于术后3 h 逐渐降低，至24h 左右恢复至正常水平后又逐渐升高，后一直保持较高的转录水平；NMDAR2A mRNA 水平于3 h 较对照组降低，于术后6 h 逐渐升高，于24 h 逐渐降低，7d 组mRNA 水平明显低于对照组（P<0.05）；NMDAR2B mRNA 水平于术后降低，12 h 左右恢复至正常水平；水迷宫结果显示：MTBE 染毒并注射GABAAR 激动剂muscimol 组大鼠学习记忆能力进一步降低，而MTBE 染毒并注射GABAAR 拮抗剂bicuculline提高大鼠的学习记忆能力。 3.2 TUNEL 染色结果显示：MTBE 可以诱导海马神经元细胞凋亡增加； Western blot 结果显示：术后各组大鼠海马p-ERK1/2 水平于术后12 h 逐渐升高，然后逐渐下降，术后第5d 和7d 低于对照组水平（P＜0.05），高剂量组下降幅度大于低剂量组。随作用时间不同，p-JNK1/2 水平逐渐升高，至12 h 时达到峰值（P＜0.05），然后逐渐缓慢下降，但直到7 d 时仍显著高于对照组水平（P＜0.05）；pp38 水平在染毒后3 h 下降，然后逐渐增高，并高于对照组水平，至5 d 时达到峰值（P＜0.05），直到7 d 时仍显著高于对照组水平，高剂量组增高幅度大于低剂量组。 结论 1．通过灌胃及呼吸道亚急性暴露，MTBE 可以通过血脑屏障； 2．侧脑室注射MTBE 可以导致大鼠学习记忆能力的下降； 3． MTBE对大鼠学习记忆能力的损伤可能涉及GABAAR和NMDAR功能的变化，这种变化可能与GABAARα1 mRNA 及蛋白表达水平的增加，NMDAR2A mRNA 及蛋白表达水平的降低有关； 4．诱导海马神经元凋亡可能是MTBE 引起大鼠学习记忆能力损伤的原因之一，其分子机制可能与JNK、p38 磷酸化水平的增高，ERK 磷酸化水平的下降相关。