计算机技术辅助构建复杂形状软骨的实验研究

摘要

耳鼻咽喉－头颈外科疾病中存在着较多的患者因软骨组织缺损而严重影响功能和外观美容。传统治疗方法是以自体软骨、异体软骨或人工材料进行修复，但现在方法因有供体来源有限、异物反应和感染等问题而使其应用受到一定限制，寻找一种理想的修复重建方法成为众多研究者探讨的热点问题。新兴的组织工程技术以生物学及工程学方法合成具有功能的损失组织替代物，有望解决上述难题。但目前组织工程技术存在着复杂形状组织或器官塑形困难，无法准确根据个体特有的解剖结构来制作支架的缺点。由于头颈部软骨组织形态比较复杂，不同个体形态差别较大，使得这一矛盾在头颈部软骨组织工程中表现得更加突出。因而，探索一种新的组织工程技术解决上述问题显得十分必要。本实验利用计算机技术辅助构建与头颈部缺损组织形态结构一致的模具，以不同的生物材料为支架，采用不同的模具成形方法构建复杂形状软骨前体，并行气管前壁缺损修复的实验研究，为头颈部软骨组织缺损的修复及重建提供理论和实验依据。 研究目的 1.研究藻酸钠凝胶的力学特性及生物相容性，确定固化剂氯化钙溶液的最佳浓度。 2.探讨由计算机技术辅助用快速成形机构建甲状软骨阴模及藻酸钙凝胶体外按阴模塑型的可行性。 3.探讨由计算机技术辅助构建β-TCP 材料的气管软骨环行气管前壁缺损修复的可行性。 材料与方法 1、藻酸钙凝胶力学特性及生物相容性的实验研究 将制备好的1.5％(w／v)藻酸钠凝胶分别与浓度为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L的氯化钙溶液混合制成高25mm,直径13mm的柱状藻酸钙凝胶，用材料试验机测定其最大可承受载荷，根据测定值绘制曲线图。取第三代兔关节软骨细胞与此浓度藻酸钠凝胶混合置入圆柱形模具中，然后将其分别浸入100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400mmol/L、500 mmol/L的CaCl2溶液中，使其交联形成圆柱状，去除模具，在DMEM完全培养液中培养，分别于1周、2周、4周、6周取出培养物，行大体及组织学观察。取人鼻中隔软骨细胞原代与浓度为300 mmol/L藻酸钙凝胶体外培养8周后，行大体及组织学观察。 2、计算机技术辅助构建甲状软骨的实验研究 选取甲状软骨骨化好的病人的连续薄层CT扫描图像。采用上海交通大学自行编制的医学断层处理软件使甲状软骨的CT扫描数据形成甲状软骨的三维数据模型，最后以STL文件格式输出。以STL文件格式把三维数据模型输入快速成形机，采用立体平板印刷技术（Stereolithography SL技术）制作出甲状软骨的阴模。用上述实验得出的最佳浓度（即300 mmol/L）的藻酸钙凝胶复合软骨细胞，在制作好的甲状软骨阴模内塑型后植入动物体内培养，8周后取材行大体及组织学观察。 3、计算机技术辅助构建气管软骨环并行气管前壁缺损修复的实验研究 计算机辅助构建气管软骨环阴模的方法与构建甲状软骨阴模的方法相同。采用凝胶注模成型技术制造出β-TCP 材料的气管软骨环。取成年狗6 只，行气管前壁3 至5 环全层缺损造模（缺损2cm×5cm）。实验组3 只用颈前带状肌封闭缺损处，其上悬吊2 个β-TCP 人工气管软骨环；对照组3 只仅用颈前带状肌封闭缺损处。术后密切观察所有动物的呼吸、进食及颈部活动情况，对存活至8 周的实验组动物行纤维喉镜检查、颈部CT 检查、大体观察及常规组织学检查；对存活至8 周的对照组动物行纤维喉镜检查、大体观察。 结果 1、藻酸钙凝胶力学特性及生物相容性的实验研究 藻酸钙凝胶抗压强度随氯化钙浓度的增加而逐渐增加。浸入100mmol/L、200mmol/L、300mmol/LCaCl2 溶液中的圆柱形细胞与藻酸钠凝胶复合体在1周、2 周、4 周、6 周时形态保持较好，在6 周时出现类软骨样改变。兔关节软骨细胞与其复合良好，并能在其中保持活性及分裂能力；浸入400mmol/L、500mmol/LCaCl2 溶液中的圆柱形细胞与藻酸钠凝胶复合体在1 周时已有部分已裂开，切片HE 染色已见不到完整的软骨细胞。根据上述试验结果CaCl2溶液浓度300mmol/L 以下细胞在其中生长均良好，300mmol/L 的藻酸钙凝胶抗压强度大于100mmol/L、200mmol/L 的，故得出300mmol/L CaCl2 浓度为此实验所需的最佳浓度。取人鼻中隔软骨细胞与此最佳浓度的藻酸钙凝胶混合培养8 周，鼻中隔软骨细胞在其中分裂增殖能力活跃。 2、计算机技术辅助构建甲状软骨的实验研究 由计算机技术辅助用快速成形机制作出树脂的甲状软骨阴模，用最佳浓度300mmol/L的藻酸钙凝胶复合软骨细胞，在制作好的甲状软骨阴模内塑型后植入动物体内培养8周后取出植入物，与植入时相比形态已不完整。常规组织切片可见软骨陷窝，藻酸钠支架材料已基本消失。 3、计算机技术辅助构建气管软骨环并行气管前壁缺损修复的实验研究 实验组动物存活良好，无明显呼吸困难，颈部活动自如，进食无呕吐，8 周后CT 检查未见支架材料的明显移位。纤维喉镜检查可见修复部位管腔未见明显狭窄，镜体可以顺利通过；处死后见支架材料与气管周围组织融为一体，管腔内有少许肉芽组织；HE 切片显示：支架材料与周围组织已融为一体，可见到已有组织长入支架材料的孔隙中。1 只对照组因皮下气肿而于手术后当晚死亡，解剖后可见颈前带状肌修复部分的气管前壁塌陷，堵塞管腔；其余2 只于术后1 周出现气喘，术后2 周出现进食呕吐，且随时间逐渐加重；8 周后行纤维喉镜检查见：去除气管环部分已塌陷，呼吸时塌陷部分几乎堵塞整个管腔，有明显反常呼吸运动出现；处死后见管腔已狭窄。 结论 1. 随着氯化钙浓度的增加藻酸钙凝胶的抗压强度亦增加；但软骨细胞呈现生长不良情况。实验结果显示：300 mmol/L 的氯化钙浓度为最佳结合点。在氯化钙浓度适当的条件下，兔关节软骨细胞及人鼻中隔软骨在藻酸钠溶胶中均生长良，可见藻酸钠是很好的细胞外基质材料。但在和软骨细胞体外共培养中容易变形，与培养中酸性物质的作用及缺少流体动力刺激有关，故需改进体外培养的装置，如改用生物反应器。 2. 由计算机技术辅助用快速成形机能准确制作出甲状软骨阴模。可见由计算机技术辅助能够按缺损软骨的形态准确构型，为不同形态软骨缺损提供更好的修复。但是由于藻酸钠成溶胶状，加之氯化钙固化的时间难以很好把握，故体外准确塑型有一定困难，故对在体外塑复杂形状，藻酸钠溶胶不是合适的材料，下一步需改进体外塑型的支架材料。 3. 用计算机技术辅助构建β-TCP 气管软骨环并行狗气管前壁缺损修复的实验研究结果可知：β-TCP 材料能按模具准确塑型，是合适的体外塑型材料。 通过对实验组动物和对照组动物的观察及各项检查结果的对比，用计算机技术辅助构建的气管软骨环有一定应用价值。