体外诱导骨髓间充质干细胞与羊膜构建角膜上皮细胞移植片用于眼表重建

摘要

研究背景：
　　健全的眼表上皮连同一个稳定的角膜前泪膜，是维持角膜生理功能的组织解剖学基础。角膜上皮结构完整、功能正常对视力有重要影响，它的更新依赖于角膜缘干细胞健全的生理功能，由角膜缘基底层的干细胞增生和分化来取代脱落死亡的细胞。角膜缘干细胞作为角膜上皮细胞增生的储备力量，在正常情况下能维持眼表的稳定状态，保持角膜的透明性，其功能缺失即会导致眼表功能失常，从而失去角膜透明性甚至角膜盲，临床常见的疾病如酸碱化学伤、先天无虹膜、Stevens-Johnson综合征等，严重的可以导致眼表组织的广泛破坏，引起持续的角膜上皮缺损、慢性炎症、角膜混浊、新生血管入侵等一系列的角膜损害，严重危及视力。目前临床针对这一类疾病多采取自体或异体角膜缘干细胞移植。然而由于自体角膜缘干细胞取材量小，存在损伤健眼的风险，且不适用于双眼患者，而异体角膜缘干细胞多由于移植排斥最终导致手术失败。因此，寻找一种取材方便、细胞量大、能替代角膜缘干细胞功能的细胞进行移植是解决这一问题的关键。
　　目的：
　　本实验的目的是采用组织工程技术，探索将骨髓间充质干细胞替代角膜缘干细胞作为种子细胞；体外诱导其分化为角膜上皮细胞后，以羊膜为载体，制成角膜上皮移植片，进行碱烧伤动物模型活体移植，观察其移植后疗效。
　　方法：
　　实验一：用羊膜和诱导的骨髓间充质干细胞构建角膜上皮移植片
　　(1)采用percoll密度梯度离心加贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，并纯化、传代，进行免疫细胞化学、扫描电镜观察，鉴定。
　　(2)用角膜基质细胞对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导分化，并进行形态学、扫描电镜、细胞表面角蛋白鉴定。
　　(3)羊膜制备：无菌条件下取新鲜足月健康产妇的羊膜，经胰蛋白酶处理后备用。
　　(4)将诱导的细胞种植于羊膜制成角膜上皮移植片，对其细胞生长状况进行观察，行免疫荧光鉴定。
　　实验二：角膜上皮移植片用于角膜碱烧伤大鼠眼表重建
　　(1)制备角膜碱烧伤大鼠模型。
　　(2)烧伤后2w进行移植手术，分为对照组、单纯羊膜移植组、角膜上皮片移植组（每组12只12眼）。术后不同时间点裂隙灯观察角膜变化；对术后4w、10w大鼠角膜评分并进行统计学分析；术后2w、4w、10w取三组大鼠眼球分别进行HE、免疫组织化学染色；术后10w三组大鼠行角膜共焦激光显微镜检查。
　　结果：
　　实验一：用羊膜和诱导的骨髓间充质干细胞构建角膜上皮移植片
　　(1)经形态学、免疫细胞化学分析分离培养的细胞符合骨髓间充质干细胞特征。
　　(2)角膜基质细胞诱导7d后的骨髓间充质干细胞经免疫细胞化学及扫描电镜检测，均符合角膜上皮细胞特性。
　　(3)将诱导后的骨髓间充质干细胞种植于经胰蛋白酶处理的羊膜，细胞贴附良好，生长7d后经观察免疫细胞化学及形态学检查，发现细胞本身的形态及性质不发生改变。
　　实验二：角膜上皮移植片用于角膜碱烧伤大鼠眼表重建
　　(1)成功制备了角膜碱烧伤大鼠模型。
　　(2)从临床观察结果看，角膜上皮片移植组荧光素钠着染面积、角膜混浊程度、新生血管面积均好于单纯羊膜移植组和对照组；从HE切片看，羊膜组与对照组均有上皮覆盖现象，但根据免疫组织化学染色结果分析，多为结膜上皮而非角膜上皮，而角膜上皮片移植组的角膜上皮抗体表达阳性，说明角膜上皮片移植组大鼠的角膜已恢复正常角膜上皮结构；角膜共焦激光显微镜结果与上述结果相符：10w角膜上皮片移植组的角膜表层上皮细胞呈多边形，扁平状，边界清晰；单纯羊膜移植组表层上皮细胞排列紊乱，反光增强，对照组上皮细胞结构紊乱，形态模糊。
　　结论：
　　骨髓间充质干细胞在体外采用角膜基质细胞诱导，可以成功分化为角膜上皮细胞；羊膜可作为细胞种植的良好载体；由羊膜与诱导的骨髓间充质干细胞一起构建的角膜上皮移植片可成功移植在角膜碱烧伤大鼠模型进行眼表重建。以上实验未见文献报道。

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前言

文 献 回 顾

一、眼表重建术进展

二、眼表重建移植载体的研究进展

三、体外培养骨髓间充质干细胞在眼表重建中的作用

正文

实验一 用羊膜和诱导的骨髓间充质干细胞构建角膜上皮移植片

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 角膜上皮移植片用于角膜碱烧伤大鼠眼表重建

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢