131I-RC-160及5-FC对共表达CD-IRES-hSSTR2肿瘤细胞的协同杀伤作用的实验研究

摘要

目的:建立稳定共表达人生长抑素受体2亚型（SSTR2）和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）的非小细胞型肺腺癌A549细胞系，并建立荷瘤裸鼠模型，通过99Tcm-RC-160进行hSSTR2介导的报告基因放射性核素受体显像，观察其显像特征；通过131I－RC-160联合5-FC进行荷瘤裸鼠肿瘤的实验性治疗并观察其治疗效果。
　　方法:应用反转录PCR方法从人胚肾293细胞中克隆人SSTR2基因，通过基因重叠延伸拼接（SOE）结合PCR方法将CD、内部核糖体进入位点（IRES2）和SSTR2连接，并构建表达载体。体外转染人非小细胞型肺腺癌A549细胞并筛选，通过间接免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot及流式细胞仪技术检测SSTR2的表达，建立稳定表达的pCIS－A549细胞株，将其植入BALB/C雄性裸鼠建立荷瘤裸鼠模型；用酒石酸亚锡作还原剂，用99Tcm直接标记RC-160，进行hSSTR2介导荷瘤裸鼠的报告基因显像，并设立接种未转染CD-IRES-hSSTR2A549肿瘤的裸鼠为对照组，于30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h等不同时间点观察其显像特征。采用NBS法进行131I标记RC-160，观察131I－RC-160加5-FC、131I－RC-160、5-FC、Na131I对移植瘤的抑制作用，等量的生理盐水作药物的空白对照，治疗结束后，计算抑瘤率，随后处死裸鼠取肿瘤组织作HE染色和免疫组化染色观察移植瘤的病理组织学变化。
　　结果:1.成功克隆了人SSTR2基因，并构建了CD和SSTR2基因的双顺反子表达载体，进一步建立了稳定转染上述表达载体的pCIS－A549细胞株，间接免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot及流式细胞仪技术检测证实了SSTR2的表达；2.99Tcm-RC-160经尾静脉注射后，30min就可见肿瘤部位显像，4-8h肿瘤显影呈放射性高度浓集影，12h持续显影，而对照组肿瘤始终未见显影。3.治疗结果统计中，把对pCIS－A549移植瘤治疗的几个组与生理盐水组比较，131I－RC-160加5-FC联合治疗组、5-FC治疗组和131I－RC-160治疗组的移植瘤生长明显受抑，其抑瘤率分别为（82.75±4.2）％、（70.69±2.9）％和（66.36±3.7）％；HE染色显示：联合治疗组的肿瘤组织大部分片状坏死，坏死区域达80％左右，131I治疗组瘤体组织也可见部分点片状坏死；免疫组化染色显示联合治疗组呈现大片坏死区域，5-FC治疗组和131I－RC-160治疗组亦呈现小片状坏死区域，131I治疗组坏死区域较小，而生理盐水治疗组则未见明显坏死区域。在各组比较中可以看出，联合治疗组的抑瘤作用明显强于其它各单种药物治疗组。Na131I组对转染或未转染的移植瘤的抑制效应比较差异无统计学差异。
　　结论:本研究建立的人非小细胞型肺腺癌细胞系(pCIS-A549)可以共表达人SSTR2和大肠杆菌CD“自杀”基因，99Tcm-RC-160可用于荷pCIS-A549肿瘤裸鼠的报告基因显像，131I-RC-160协同5-FC治疗荷pCIS肿瘤的抑瘤效果优于单独应用131I-RC-160或5-FC。利用CD-IRES-hSSTR2，协同“自杀基因/前体药物”及放射性核素标记SSA，为实现非小细胞肺癌及不表达SSTR受体的其他肿瘤的受体显像及受体介导治疗提供了新的可能的途径。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、 SSTR 及 SST/SSA 的研究进展

二、 SSA抗肿瘤机制

三、放射性核素标记生长抑素类似物的方法与现状

四、生长抑素受体显像与放射性核素治疗1、生长抑素受体显像

五、 关于“自杀”基因与联合基因治疗的研究1 自杀基因疗法的概念及类型

第一部分建立供表达 CD-IRES-hSSTR2 基因的 A549 细胞系

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分99mTc-RC-160 在荷 pCIS-A549 肿瘤裸鼠体内的放射受体显像研究

1. 材料与方法

2 结果

3. 讨论

第三部分131I-RC-160 及 5-FC 对裸鼠体内转染 CD-IRES-hSSTR2基因 A549 移植瘤的协同抗肿瘤效应观察

1. 材料与方法

2.结果

3.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢