改良的气体环境对体外骨髓间充质干细胞培养影响的实验研究

摘要

在组织工程瓣膜（tissue engineering heart valve，TEHV）的研究过程中，如何短时间获取大量功能状态良好的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），维持MSCs的原始状态，及控制MSCs分化方向是当前研究的热点。影响MSCs生长、功能状态及分化的因素很多，包括O2浓度、PH值、温度、生长因子、血清、培养基、剪切力、细胞密度等。微环境中O2浓度及PH值是非常重要因素：O2对MSCs的影响是多个方面的，适当的O2浓度可以促进MSCs的增殖、分化、原始状态的维持；MSCs对培养环境的PH值的变化非常敏感，不同PH值对MSCs的增殖、分化及生物学功能有着显著影响。目前传统的细胞体外培养环境中O2浓度约为21％，CO2浓度约为5％，所用培养基PH值为7.2～7.4。而人体正常组织和组织间隙中的O2浓度3％～9％，骨髓腔内O2浓度1％～7％；动脉血CO2浓度约5％,静脉血CO2浓度约6％,骨髓腔内CO2浓度约7％；人体动静脉血液及骨髓腔内pH值恒定在7.20～7.50间。目前，低氧环境能显著影响干细胞的增殖和生长因子的分泌，但未见低氧对种子细胞黏附功能影响的研究报道。为此，我们分别采用6％O2的培养环境培养MSCs，探讨低氧环境对MSCs增殖功能及粘附功能影响。同时针对传统的细胞培养液如DMEM,DF-12,M199等均随着使用或存放时间的延长，培养液的pH值会明显升高，我们首次尝试7％CO2环境来增强培养液中CO2/HCO3-缓冲能力，稳定培养液pH值，探讨此种稳定的培养环境对MSCs增殖及细胞原始状态的影响，旨在探索合适的细胞培养的条件。
　　第一部分：小鼠MSCs细胞分离、纯化、扩增并鉴定：经Percoll密度梯度离心和贴壁生长的方法从采集的小鼠骨髓液中提取，倒置显微镜观察其形态，通过免疫组化及流式细胞仪来进行鉴定。
　　结果：选取的6个培养瓶的小鼠MSCs，进行免疫组化染色显示：ɑ-SMA,Vimentin均呈阳性表达；小鼠MSCs流式细胞仪鉴定示：CD29,CD44,CD90及CD105呈现高度阳性表达，阳性率分别为92.7％，99.6％，99.5％及99.4％，而CD34和CD45阳性表达率仅分别为4.6％和3.2％。结果表明经此种方法分离纯化而来的细胞为骨髓间充质干细胞。
　　第二部分：6％O2与21％O2条件下小鼠MSCs增殖、粘附及细胞外基质表达量的比较：两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞，一共分为6个对照组，分别进行增殖实验，粘附实验，及通过Western-blotting测定FN及VN的表达，初步评价两种不同O2环境下MSCs的增殖、分泌及粘附功能状态。
　　结果：6％O2条件下培养的小鼠MSCs较21％O2有更强的增殖能力(p<0.05)、粘附能力(p<0.05)及分泌功能(p<0.05)。
　　第三部分：7％CO2与5％O2条件下小鼠MSCs增殖能力及OCT-4蛋白表达量的比较：两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞，一共分为6个对照组，分别进行增殖实验，及通过Western-blotting测定OCT-4蛋白的表达，初步评价两种不同CO2环境下MSCs的增殖及干细胞原始状态的维持。
　　结果：7％CO2条件下培养的小鼠MSCs较5％CO2有更强的增殖能力(P<0.05)；同时OCT-4蛋白的表达含量也较高，表明7％CO2条件更有利于小鼠MSCs原始状态的维持(P<0.05)。
　　第四部分：7％CO2+6％O2与5％CO2+6％O2条件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始状态维持的比较：两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞，一共分为6个对照组，分别进行增殖实验，粘附实验，及通过Western-blotting测定FN及OCT-4的表达，初步评价两种不同气体环境下MSCs的增殖、粘附功能及原始状态维持。
　　结果：7％CO2+6％O2条件下培养的小鼠MSCs较5％CO2+6％O2有更强的增殖能力(P<0.05)及粘附能力(P<0.05)，同时OCT-4的表达更高(p<0.05)。
　　结论：O2和PH值是细胞生长的重要的微环境，对MSCs的增殖、分化有着重要影响。通过模拟生物体内微环境来进行MSCs的体外培养，有利于快速获取理想的质和量的种子细胞，对组织工程的研究有着积极的意义。

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前言

文献回顾

1．氧与 MSCs

2 PH 值与 MSCs

3 结语

研究内容（正文）

第一部分 种子细胞分离、培养和鉴定

1材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 6% O2与 21% O2对小鼠MSCs增殖、粘附及细胞外基质表达影响的比较

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4．讨论

第三部分 7%CO2 与5%CO2对小鼠MSCs增殖及原始状态维持的影响的比较

1 试剂和仪器

2．结果

3．讨论

第四部分 7%CO2 +6% O2与7%CO2 +21% O2条件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始状态维持的比较

1 试剂和仪器

2 方法

3．讨论

小 结

参考文献

附 图：

个人简历

硕士期间发表文章

致谢