猪实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及其脊髓磁共振弥散张量成像研究

摘要

研究背景:
　　多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统(centralnervessystem,CNS)的炎性脱髓鞘疾病。临床上以病变部位及发病次数的多发性为特点。病理上以中枢神经系统中局灶性脱髓鞘和不同程度的炎性病变﹑轴突损伤和胶质瘢痕的形成为特征。虽然多发性硬化的标志性病理改变是脱髓鞘，然而最近的研究表明轴突的病理改变在疾病的早期阶段业已存在。脊髓病变在多发性硬化患者中广泛存在，而且研究表明因轴突丧失而引起的脊髓萎缩与多发性硬化患者永久性神经功能障碍密切相关。迄今为止，人们对于轴突损伤的病理机制知之甚少，且没有任何一种有效的治疗能够阻止轴突的损伤。因而寻找一种新的有效手段用于研究轴突损伤的潜在病理机制并对治疗的有效性进行精确的监测是迫切而必要的。
　　核磁共振（MagneticResonance,MR）技术广泛用于多发性硬化的研究，然而传统的MR技术并不具有病理特异性。近年来诸如弥散张量（diffusiontensorimaging，DTI）、氢质子磁共振波谱（1H-MRspectroscopy，1H-MRS）、磁化传递成像（MagnetizationTransferImaging，MTI）等等一些具有相对病理特异性的MR新技术被用于MS病理机制的研究。特别是DTI技术能有效检测轴突损伤并与脱髓鞘病变相区别。为MS病理机制的研究开辟了新的途径。
　　对人体而言，活捡和尸检是研究MS病理机制的两种有效途径。然而由于只能获得MS病程中的间断性数据，这些数据的可靠性和完整性难免受到一定的限制。因而建立有效的MS动物模型是必要的。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalallergicencephalomyelitis,EAE）是一种自身免疫性神经系统疾病，被认为是MS的首选动物模型。人们对MS病理机制及治疗的认识部分来源于EAE模型。啮齿类动物被广泛应用于EAE模型的建立。遗憾的是，由于啮齿类动物较小的中枢神经系统尤其是脊髓体积，其EAE模型并不适合于核磁共振研究。即使使用高场微型磁共振系统（high-fieldmagneticresonancemicroimagingscanner），许多新技术的应用仍然受到一定限制。少量研究使用灵长类动物模型进行MR研究，然而由于灵长类动物获取困难且价格昂贵，因而难以进行大规模研究。最近的研究表明，猪是一种较适合建立EAE模型的大型动物。
　　研究目的:
　　1.（1）建立可靠的适合MRI成像的猪EAE模型。
　　（2）对EAE模型脊髓病变的病理机制进行研究。
　　2.（1）评估3T临床MRI系统用于猪脊髓轴位DTI成像和定量检测的可行性。
　　（2）定量分析DTI参数﹑脊髓病理改变和EAE临床分数的相关性。
　　（3）评估DTI参数监测EAE发病及疾病进展的能力。
　　材料与方法:
　　1.应用牛脊髓匀浆(spinalcordhomogenate,SCH)、福氏佐剂和结核杆菌免疫雌性45-50kg的商品猪，耳静脉注射百日咳杆菌，诱发猪EAE动物模型。
　　2.应用组织病理染色和免疫组化技术研究EAE的病理机制，具体包括：苏木素－伊红(Hematoxylin-Eosinstaining,HE)染色显示炎性浸润，LFB(Luxolfastblue)染色显示脱髓鞘病变，Glees银染显示轴突丧失，淀粉样前体蛋白(Myloidprecursorprotein,APP)免疫组织化学染色显示急性轴突损伤。
　　3.5头正常雌性45-50kg的商品猪用于评估3T临床MRI系统进行猪脊髓DTI成像和定量检测的可行性。3T临床MRI系统对猪脊髓进行常规T1WI、T2WI及DTI成像，DTI扫描采用基于平行采集技术（IntegratedParallelacquisitiontechniques，iPAT）的平面回波（EchoPlaneImaging，EPI）脉冲序列。定量测量C2/C3平面脊髓轴位白质四个不同感兴趣区（前柱，左侧柱，右侧柱和后柱）的轴向弥散（Axialdiffusivity，AD)、径向弥散（radialdiffusivity，RD)、部分各向异性（fractionalanisotropy，FA)和表观弥散系数（apparentdiffusioncoefficient，ADC)值。测量采用西门子公司的SyngoMRB13图像分析软件平台。用Bland-Altman法对DTI各参数的可重复性进行评估，统计软件采用MedCalcV7.5。
　　4.8头急性猪EAE模型(P1－P8)用于定量分析DTI参数﹑脊髓病理改变的相关性。分别于不同病程阶段（两头在进展期，临床分数分别为1和3；两头在峰值期，临床分数均为5；两头在缓解期，临床分数分别为4和2；两头在完全缓解期，临床分数为0）行MR扫描。于MR扫描后立即处死取脊髓标本分别进行组织病理和免疫组化染色。对DTI和定量病理改变进行相关性分析，统计软件采用SPSS14。
　　5.2头急性猪EAE模型(EB、EC)用于评估DTI参数监测EAE发病及疾病进展的能力。在EAE疾病的全程，每日评估动物的临床分数，分别在不同的时间点行MRI扫描并定量测量DTI参数值。用Spearman秩相关对DTI和临床分数进行相关性分析，统计软件采用SPSS14。
　　结果:
　　1.通过后腿皮内多点注射牛脊髓匀浆、福氏佐剂和结核杆菌，耳静脉注射百日咳疫苗的方法，成功建立了急性猪EAE模型。病程表现为急性单向完全缓解型。
　　2.急性猪EAE模型的脊髓病理改变以炎性细胞浸润和急性轴突损伤为主。仅在疾病峰值期可见少量脱髓鞘改变。在缓解期可见少量轴突丧失且在临床症状完全缓解后少量轴突丧失持续存在。
　　3.采用基于iPAT技术的EPI脉冲序列，3T临床MRI系统可以获得较高质量的猪脊髓DTI图像。Bland-Altman法评估显示脊髓DTI参数值具有较好的可重复性。AD,RD,FA,和ADC的正常值分别为1.81×10-3(±0.06)mm2/s,0.32×10-3(±0.02)mm2/s,0.72×10-3(±0.08)和0.95×10-3(±0.11)mm2/s。这些DTI参数值与正常人脊髓的DTI参数值基本相符。
　　4.AD值随急性轴突损伤的增加而下降，两者呈明显负相关(r=-0.84,P<0.001)，FA与急性轴突损伤虽然也有负相关的趋势但相关性不强(r=-0.31,P<0.05)。
　　5.AD与临床分数间表现出很强的相关性(两只动物的相关系数分别为：r=-0.86,P<0.001；r=-0.92,p<0.001)。
　　结论:
　　1.牛脊髓匀浆能有效诱导急性单向完全缓解型猪EAE模型。静脉注射百日咳疫苗、高剂量结核杆菌、皮内注射可能是促进EAE发病的有利因素。
　　2.急性猪EAE的脊髓病理改变以炎性浸润和急性轴突损伤为主。伴有少量的脱髓鞘病变。急性轴突损伤可能独立于脱髓鞘病变而单独存在。绝大多数急性轴突损伤是可逆的。急性轴突损伤可能是引起猪EAE临床神经功能障碍的主要因素。
　　3.采用基于iPAT技术的EPI脉冲序列，3T临床MRI系统能获得较好的猪脊髓DTI图像且能进行DTI参数的轴位定量测量。猪EAE模型是进行MRI研究的较好动物模型。
　　4.AD值在时间和空间上均能反映脊髓轴突的急性损伤，AD是检测脊髓轴突损伤的特异性参数。
　　5.AD是监测脊髓轴突损伤的敏感参数，AD可能是研究MS和EAE模型轴突损伤的病理机制并且进行轴突损伤治疗效果监测的敏感指标。

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言

文献回顾

一、MRI 在多发性硬化病理机制研究中的应用

二、EAE 的 MR 研究进展

三、多发性硬化和 EAE 的轴突损害

四、MS 的脊髓病变及 MR 应用1 MS 脊髓病变的发生率及 MRI 表现

第一部分猪实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立及其脊髓病变病理机制的研究

引言

实验一、猪 EAE 模型的建立

实验二、急性猪EAE模型脊髓病变病理机制的研究

第二部分急性猪 EAE 模型脊髓病变的 DTI－病理相关性研究及 DTI 参数监测 EAE 疾病能力的评估

引言

实验一、脊髓 DTI 扫描序列的选择、扫描参数的优化及脊髓轴位DTI 参数测量可重复性研究

实验二、急性猪 EAE 模型的脊髓定量 DTI－病理相关性研究

实验三、 DTI对急性猪EAE脊髓病变的全病程监测

小 结

参考文献

个人简历

博士期间待发表论文

致谢