Fe2+和/胰岛素对葡萄糖预处理的人脐静脉平滑肌细胞增殖及MMP-2分泌的作用

摘要

研究背景：
　　冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（coronary heart disease，CHD），是影响人类健康的主要疾病之一，经皮冠状动脉内成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）目前已经成为一种常规有效的治疗CHD的方法。药物支架（drug-eluting stent，DES）的使用使支架置入术后支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）的发生率降低到5～10％左右，但仍然无法彻底解决ISR的问题。大量的多中心、随机和双盲对照研究显示，糖尿病（diabetesmillitus，DM）患者PTCA的疗效差，ISR发生率较高[1-3]，具体机制的研究仍不够深入，因而严重影响其临床应用。同时有研究显示，置入体内的金属支架在体内会以“洗脱”的方式脱出Fe2+[4]，不同类型支架“洗脱”到支架周围的Fe2+量并非完全一致，而且其对与之直接接触的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的生物功能的影响尚不清楚。有研究认为Fe2+对VSMC增殖有一定程度抑制作用[5]，此研究结论似乎与临床观察到的现象不相符合。为此，本研究采用原代培养的3～5代人脐静脉平滑肌细胞（human umbilical vascular smooth muscle cell，HUSMC），参照上述研究[5]采用的Fe2+浓度梯度分组，分别用普通培养液模拟正常人体内环境、高糖培养液模拟人体内高糖环境、高胰岛素环境模拟人体高胰岛素环境培养HUVSMC，以研究Fe2+、胰岛素对其增殖以及金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）分泌功能的影响，探讨血糖异常和/或胰岛素抵抗患者体内金属支架ISR发生的可能机制并找寻临床证据。
　　研究目的：
　　1.观察Fe2+对葡萄糖预孵育的VSMC增殖及MMP-2分泌的影响。
　　2.观察胰岛素对葡萄糖预孵育的VSMC增殖及MMP-2分泌的影响。
　　3.观察Fe2+对葡萄糖和胰岛素预孵育的VSMC增殖、MMP-2分泌以及VSMC胞内Ca2＋浓度的影响。
　　4.探讨其可能的作用机制。
　　第一部分：
　　方法：
　　健康产妇剖宫产分娩的无菌胎儿脐带分离出脐静脉，组织块法培养HUVSMC，取生长稳定的3～5代细胞，分为正常组（葡萄糖5mmol/L）以及高糖组（葡萄糖25mmol/L）的。
　　1.各分为六个亚组：①空白对照组O；②Fe2+组A（0.00625mg/mL）；③Fe2+组B（0.0125mg/mL）；④Fe2+组C（0.025mg/mL）；⑤Fe2+组D（0.05mg/mL）；⑥Fe2+组E（0.1mg/mL）。37℃、5％CO2培养箱内干预24h。
　　2.MTT比色法测定细胞增殖情况。
　　3.ELISA试剂盒检测细胞培养上清中MPP-2含量。
　　结果：
　　1.正常组：与O组比，B～E组对VSMC有促进增殖作用（P＜0.05）；仅E组能明显促进VSMC分泌MMP-2（P＜0.01），其余各组与对照组间差异无统计学意义。
　　2.高糖组：与O组比，B～E组，能促进VSMC增殖（P＜0.01）及MMP-2的分泌，D组、E组促进作用最强。
　　3.正常组与高糖组比较：B～E各相应亚组间，高糖组对VSMC增殖及MMP-2分泌的促进作用较正常组强（P＜0.05）。
　　结论：
　　正常及高葡萄糖环境，适当的浓度Fe2+能影响VSMC的生物学特性，促进VSMC的增殖与MMP-2的分泌，且高糖环境下作用更为显著。
　　第二部分：
　　方法：
　　1.同实验一。
　　2.各分为4个亚组：①空白对照组O；②胰岛素组A（10mIU）；③胰岛素组B（100mIU）；④胰岛素组C（1000mIU）。37℃、5％CO2培养箱内干预48h。
　　3.MTT比色法测定细胞增殖情况。
　　4.ELISA试剂盒检测细胞培养上清中MPP-2含量。
　　结果：
　　1.正常组：与O组比，各亚组均可促进VSMC增殖（P＜0.01）及MMP-2的分泌（P＜0.01），且B组（100mIU）作用最强。
　　2.高糖组：与O组比，A组、B组均促进VSMC的增殖（P＜0.05）；但A、B、C三个亚组均能促进MMP-2的分泌（P＜0.01），且B组（100mIU/L）作用最强。
　　3.正常组与高糖组比较：A、B各相应亚组间，高糖组对VSMC增殖及分泌MMP-2作用较正常组强（P＜0.05），而相应C组间高糖组对VSMC增殖及分泌MMP-2作用较正常组弱（P＜0.01）。
　　结论：
　　正常及高葡萄糖环境，适当浓度的胰岛素能促进VSMC增殖及MMP-2的分泌，效应具有浓度依赖性；且高糖环境下促进作用更为显著。
　　第三部分：
　　方法：
　　1.同实验一。
　　2.各分为4个亚组：①空白对照组O（10％FBS的DMEM，72h）；②Fe2+组A（10％FBS的DMEM，48h+0.05mg/mLFe2+，24h）；③胰岛素组B（10％FBS的DMEM，24h+100mIU胰岛素，48h）；④胰岛素+Fe2+组C（100mIU胰岛素，48h+100mIU胰岛素及0.05mg/mLFe2+，24h）。
　　3.MTT比色法测定细胞增殖情况。
　　4.ELISA试剂盒检测细胞培养上清中MPP-2含量。
　　5.激光共聚焦法测定细胞内Ca2+浓度。
　　结果：
　　1.正常组：与O比较，A、B、C各组VSMC内Ca2+浓度均升高，VSMC增殖及MMP-2分泌能力增强。其中A、B组较C组促进VSMC胞内Ca2+浓度升高的作用高（P＜0.01），促进VSMC增殖及MMP-2分泌作用强（P＜0.05）。
　　2.高糖组：与O比较，A、B、C各组VSMC内Ca2+浓度均升高，VSMC增殖及MMP-2分泌能力增强。其中A、B组促进VSMC胞内Ca2+浓度升高、促进MMP-2分泌作用较C组强（P＜0.01），三组促进VSMC增殖作用无明显差异（P=0.484）。
　　3.正常组与高糖组比较：高糖组A、B各相应亚组间对VSMC增殖及分泌MMP-2作用较正常组强（P＜0.05），C组两相应亚组间无明显差异（P=0.167）。高糖组A～C各亚组细胞内Ca2+浓度均高于正常组（P＜0.05）。
　　结论：
　　正常及高葡萄糖环境下，适当浓度的胰岛素、Fe2+能促进VSMC增殖、MMP-2的分泌以及VSMC胞内Ca2+浓度升高，且高糖组促进作用更为明显。正常及高葡萄糖环境下，胰岛素、Fe2+单独作用促进MMP-2分泌、VSMC胞内Ca2+浓度升高作用较胰岛素、Fe2+共同作用时强。促进VSMC增殖作用，在正常葡萄糖环境下，胰岛素、Fe2+单独作用时较胰岛素、Fe2+共同作用时强，但在高葡萄糖环境下三者作用无明显差异。

目录

封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文 献 回 顾

一 PCI 术后 RS 与 DM 的关系

二 胰岛素与 RS 的关系

三 Fe2+与 RS 发生的关系

四 MMP-2 与心血管系统疾病关系

正 文

实验一 Fe2+对 VSMC 增殖及分泌 MMP-2 的影响

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

实验二 胰岛素对 VSMC 增殖及分泌 MMP-2 的影响

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

实验三 Fe2+和/或胰岛素对 VSMC 增殖及MMP-2 分泌的影响

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

小 结

参考文献

附 图

个人简历与研究成果

致谢