先天性静止性夜盲(CSNB)模式大鼠的临床表型研究

摘要

先天性静止性夜盲（congenitalstationarynightblindness,CSNB）是一类先天性、非进行性视网膜疾病，可分为常染色体显性遗传(autosomaldominant，AD)，性连锁隐性遗传(X-1inkedrecessive，XL)，常染色体隐性遗传(autosomalrecessive，AR)，以XL型CSNB为主，不同遗传方式的CSNB临床表现有一定差异，但功能上都以视网膜杆体系统严重受损为主要特征。此病的发病机制尚不十分明了，且目前缺乏有效的治疗手段。模式动物是研究基因和蛋白功能的重要支撑条件，也是研究疾病防治和药物开发的重要手段，因此模式动物的开发和利用引起了各国同行的关注，由于自然突变模式动物难以筛选，且其与人类疾病的发生最为接近，因此弥显珍贵。本实验室在实验中发现一种视网膜电图（ERG）异常大鼠，经遗传学和视觉电生理学鉴定，确定为一种类似人类CSNB疾病的模式大鼠，并已经建立近交系。CSNB模式大鼠对研究人类CSNB疾病的潜在伴随的其他病变，发病机制及治疗方法都有广阔的研究前景。此CSNB模式大鼠初步被鉴定为不完全型先天性静止性夜盲（incompletecongenitalstationarynightblindness,iCSNB）模式大鼠，目前大量文献报道人类疾病的研究及通过动物实验，均证实iCSNB的致病基因为CACNA1F,由于此基因发生突变而导致视杆系统视觉信号从光感细胞到二级神经元的传导发生障碍。
　　本实验主要分为三大方面，依照对实验结果的观察总结，采用循序渐进的方式进行了逐步研究。1、对我室建立的一种新的、具有我国自主知识产权的视网膜疾病模式动物品系（CSNB）大鼠基本血液生理学及生化参数进行了测量；对CSNB模式大鼠进行了出生后视觉功能发育的监测，并与相应时程视网膜组织形态学进行对比。用免疫组化方法标记二级神经元细胞，对比正常Sprague-Dawley(SD)大鼠，了解了CSNB大鼠的病程发展；研究了flickerERG的特征性改变;2、以视觉功能的客观检测为基础，观察了CSNB大鼠的行为学特征。
　　材料与方法：
　　实验运用本实验室发现并正在建立近交系的CSNB大鼠及正常同龄对照SD大鼠，利用全自动生化分析仪、自动电解质分析仪、自动血细胞分析仪等检测CSNB大鼠血液生化指标；采用视觉电生理检查技术，观察实验动物的视网膜功能变化；利用光镜及电子透射显微镜对视网膜组织进行了超微结构观察；通过Morris水迷宫系统、Rotarod检测、旷场实验、避暗反应，观察视觉缺陷模式大鼠的主观行为表现。
　　结果：
　　1．CSNB模式大鼠基础生理值
　　CSNB大鼠基础生理值的研究结果显示，CSNB大鼠脏器重量雌性与雄性之间除脾脏、肾上腺、垂体外，其余均存在显著差异（P<0.05）；脏器系数大脑、小脑、脑干雌雄间存在非常显著差异（P<0.001）；血液指标RBC、HGB雄性高于雌性，但无显著差异；生化指标GLU、CHO、ALB雌性大于雄性，而ALT、AST、ALP、BUN、CRE、TG、TP雌性小于雄性，经统计学处理无显著差异（P>0.05）。
　　2.CSNB模式大鼠视网膜发育与视觉功能发育的特点
　　CSNB大鼠的视网膜电图（ERG）Max-ERGa波潜伏期较SD大鼠从大鼠开睑到6个月均显著延长（P<0.05），CSNB大鼠a波幅值2月后就逐渐下降，而SD大鼠约在3、4月达高峰后幅值缓慢下降，4、5、6月CSNB大鼠较SD大鼠幅值显著下降（P<0.05）。CSNB大鼠cone-ERGb波潜伏期较SD大鼠除4月外均有显著差异，b波幅值较SD大鼠各时间点均显著下降（P<0.05）。SD大鼠与CSNB大鼠在2m、4m、6m各时期，外核层、内核层、内网层、神经节细胞层厚度，细胞数相似，但外网层厚度在每个时期，CSNB大鼠均较SD大鼠薄。CSNB大鼠与SD大鼠PKCa染色表现部位、强度相似，仅CSNB大鼠的外核层较薄。而CSNB大鼠CalbindinD-28K染色后，显示水平细胞及水平细胞树突明显减少。CSNB外网层中突触的ribbon小体稀少，而SD大鼠的ribbon丰富。
　　3.CSNB大鼠闪烁光视网膜电图的特点
　　观测CSNB大鼠和锥体细胞失功能（retinalconedysfunction,RCD）大鼠与SD大鼠的flickerERG特征，结果表明暗视条件下：CSNB①大鼠与SD大鼠相比较所测得幅值有显著差异（P<0.001），20HzSD大鼠存在第一个高大flicker反应波，而CSNB大鼠无现象；RCD②大鼠与SD大鼠幅值无显著性差异（P>0.05），但在20Hz刺激时RCD大鼠已无规律flicker波，而SD大鼠要到30Hz才无规律连续波。明适应条件下：CSNB①大鼠与SD大鼠波形相似，而CSNB大鼠幅值明显低于SD大鼠（P<0.001），有统计学意义；SD大鼠直到62Hz前均能引出Flicker反应波。②RCD大鼠没有明确波形。蓝光暗视条件下：CSNB大鼠弱光强刺激下无明确反应，在高光强、高频率下易引出波形。
　　4．CSNB模式大鼠行为学特点
　　低视力模式大鼠行为学的初步研究中，观测CSNB大鼠与锥体细胞功能不良RCD大鼠和SD大鼠的行为表现。结果显示水迷宫实验，定位航行实验：两组大鼠每天学习训练的逃逸距离都较SD大鼠延长(P<0.001)；空间探索实验：两组大鼠测试时在第二象限游泳时间较SD大鼠少（P<0.001）。非空间学习记忆训练示，CSNB组较SD组进入暗箱所需时间显著延长（P<0.05）；RCD大鼠避暗反应错误次数增加与SD大鼠相比有显著性差异（P<0.05）。旷场实验中CSNB大鼠逃逸距离203.89±126.20cm与RCD大鼠271.41±203.76cm，较SD组145.17±88.89cm延长均有显著性差异；逃逸时间比较，CSNB组较SD组延长差异有统计学意义。观察连续四天Rotarod训练，经重复测量得到CSNB、RCD两组大鼠均较SD大鼠运动时间显著减少。
　　结论：
　　1．CSNB大鼠基本生理和生物化参数均在正常范围内，本实验室培育的CSNB品系大鼠已表现出稳定的基本生理指标。2．CSNB大鼠各时期视觉电生理功能较SD大鼠差。视网膜组织形态、免疫组化改变支持视觉信号向二级神经元传导过程异常。3．CSNB大鼠的视杆系统严重受损并伴随视锥细胞部分受损；RCD大鼠视杆细胞功能良好，视锥细胞完全失能。暗适条件下SD大鼠视杆细胞对20Hz刺激最敏感，视锥细胞最大融合频率约为62Hz。4．CSNB大鼠空间和非空间的学习记忆能力降低，运动耐力降低。

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缩 略 语 表

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前 言

文 献 回 顾

1．CSNB疾病

2．Schubert-Bornschein型CSNB的遗传学研究

3．CACNA1F编码的Cav1.4通道蛋白

4．CSNB模式动物的研究

5．小结

正 文

第一部分 先天性静止性夜盲模式大鼠遗传表型观察

第二部分 CSNB 大鼠的行为学研究

论 文 小 结

参考文献

附录

个 人 简 历

攻读学位期间所发表的论文

致谢