改性PEG水凝胶—去细胞生物复合支架材料构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

摘要

人工瓣膜置换术是目前世界上治疗心脏瓣膜疾病的主要常规方法，人工瓣膜包括机械瓣和生物瓣两大类。它的发明挽救了大部分瓣膜病患者生命，并提高了其生存质量。但是都未达到理想程度，比如机械瓣需要终生抗凝，并且存在潜在性的出血、血栓形成和瓣体脱落引起栓塞的危险；生物瓣耐久性不足，易钙化、变性、衰败、穿孔而失去功能。最重要的是人工瓣膜不具有再生长的性能，特别是主要应用于儿童的同种管道等等，因而在儿童病人的应用中受到极大的限制[1,2],目前只有自体管道如Ross手术中将自体肺动脉移植到主动脉位置，才能保持瓣膜和管道的继续生长[3],但是Ross手术要求技术难度高，风险大并且也只能适用于很少的一部分儿童病人，而且尚存在一些不确定因素—例如管道是否确切地能担负起同步生长而完全适应其未来的生理需要呢[4]？所以寻找一种更加完善的瓣膜替代物，研发组织工程心脏瓣膜是其中一项具有广阔前景的方法并且已经取得了可喜进展。
　　组织工程学就是应用生物学和工程学的原理来发展一种可替代的组织，代表了一种新兴的科学概念，在体外制造出有活性细胞的间质组织并具有抗血栓的表面，从而拥有自我修复和再塑形的能力，从而克服上述缺陷。截止目前，世界上已经有组织工程皮肤和组织工程膀胱研制成功的报道。
　　现行组织工程的研究内容有三个关键部分，种子细胞选择、支架材料选取和复合技术的改进。早期，大多数组织工程瓣膜实验研究中多采用血管来源细胞，从而不可避免地具有一定缺陷，如细胞的收集必须要牺牲供体完整的血管结构，并且因其细胞特性不同于瓣膜间质细胞，可能影响组织工程瓣膜的功能。骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）可由受体骨髓采集，在体外分离和扩增而获得，并且可定向分化成各种细胞，包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等等，亦有报道称有向内皮细胞方向分化者。本课题选择羊BMSCs作为种子细胞，因为其易于通过简单的骨髓穿刺而获取，可以避免增加副损伤；BMSCs具有多向分化潜能、且能贴附在异体支架材料上生长扩增，在一定的微环境下有向瓣膜间质细胞和内皮细胞分化的可能性。支架材料仍采用本中心研究的去细胞猪主动脉瓣膜支架作为组织工程心脏瓣膜支架、并着重引进PEG水凝胶技术，改进细胞与材料支架的复合方法，进行体外构建组织工程心脏瓣膜；然后植入细胞供体羊的腹主动脉内进行观察，避免免疫排斥反应的干扰，观察体内微环境对组织形成和细胞分化的影响。对组织工程心脏瓣膜的构建进行进一步的研究与探索。
　　第一部分：分离、纯化、扩增并鉴定羊BMSCs细胞：经Percoll密度梯度离心和贴壁生长的方法从采集的羊骨髓液中提取，通过倒置显微镜观察其形态，通过免疫组化及定向分化来进行鉴定。结果：羊BMSCs免疫组化染色显示：SH2,Vimentin均呈阳性表达。CD34和VIII因子相关抗原的表达均为阴性。经向脂肪细胞定向诱导分化后，油红O染色显现明显的胞内脂滴。结果表明经此种方法分离纯化而来的细胞为骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能，而且细胞数量和活性满意：10～15ml/羊的骨髓在20d左右经4～6代培养后即可达到(6.52±0.24)×107细胞数量级，能满足组织工程种子细胞的需求。；
　　第二部分：去细胞猪主动脉瓣和改性PEG水凝胶的制备：采用渗透压和Triton-X100结合的办法制备去细胞猪主动脉瓣膜支架，并且进行PEG水凝胶的改性，结合RGD、TGF-β1和VEGF，将BMSCs静态种植于其上进行培养，并对种植细胞的效果进行初步评价。结果：应用组织切片HE染色和扫描电镜的方法证实BMSCs细胞的生物相容性较好，PEG水凝胶可以混匀细胞，并将细胞紧密结合到去细胞生物支架上[PEG-TEHV组的细胞贴附率明显高于Non-PEG组(2.592±0.005vs1.885±0.004)]；摸索出有效贴附到瓣膜上的细胞接种方法，可提高种子细胞的贴壁率和有效分布，为下一步体内实验打下基础；
　　第三部分：体内腹主动脉移植实验：以去细胞猪主动脉单瓣为支架、自体BMSCs为种子细胞包裹于改性PEG水凝胶完成细胞与支架的复合过程，当单叶的组织工程瓣膜种植进细胞供体羊的腹主动脉内，我们进行BMSCs种子细胞的体内分化趋势的观察。组织工程心脏瓣膜(PEG-TEHV)作为A组；种植BMSCs细胞但无PEG包被处理作为B组；山羊自身主动脉瓣膜设为C组为对照。分别于术后第16周后取材进行形态、组织学、扫描和透射电镜观察以及生物力学检测。分析BMSCs细胞在体内的分化方向及比较三组之间的异同。结果：A组张力强度、内皮细胞覆盖率明显优于B组(0.85±0.02：0.14±0.01)；其中A组：B组附壁血栓形成率为0：100％；A组生物力学强度接近羊自身主动脉瓣膜；并且骨髓间充质干细胞于体内微环境下向内皮细胞和肌成纤维细胞等细胞分化。利用改性聚乙二醇（PEG）水凝胶复合去细胞生物支架材料以及自体骨髓间充质干细胞构建组织工程瓣膜具有可行性。

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前言

水凝胶复合支架材料构建 TEHV 展望（文献回顾）

研究内容（正文）

第一部分 种子细胞体外分离、培养、扩增和鉴定

第二部分 改性生物支架材料制备

第三部分 动物体内实验——山羊腹主动脉内瓣膜种植

小 结

参考文献

致谢