HBV X-DNA:早期检测拉米夫定治疗中耐药性发展的血清标志物

摘要

目的：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共健康问题。我国是HBV感染的高发区，在全世界3.5亿无症状HBV携带者(chronic asymptomatic HBV carrier,AsC)中，中国占1.3亿，慢性乙型肝炎患者2800万。HBVDNA有4个重叠的开放式阅读框架（Open Reading Frame,ORF），即：PreC/C、多聚酶、PreS1/PreS2/S和X基因，其可被转录到基因组和前基因组RNA分子中。其中最小的病毒转录体HBx翻译产物被认为是肝癌的致癌因子，HBx的特性包括刺激转录和信号转导、干扰DNA修复、诱导凋亡、促进体内体外的恶性转化。在HBV复制期间，在HBxORF产生两种病毒转录体，即：全长型转录体（Full-length RNA，fRNA），Poly(A)信号成熟位于（1789位）UAUAAA结构区；及顿挫型转录体（Truncated RNA trRNA），成熟的Poly(A)信号位于（1661位）CAUAAA结构区。后者隐藏于HBx基因ORF内，只有当fRNA成熟信号被灭活时，trRNA成熟信号才具有活性。1996年Schutz等建立用于检测肝组织内HBV转录体的方法；2001年以来，Su和Zhang等先后建立了从血清中检测这两种转录体的定性和定量检测方法。本实验室前期关于血清HBV核酸研究结果表明，短期拉米夫定治疗慢性感染患者引起阻断于负链合成早期的复制早期中间体的快速波动。相反，病毒mRNA的形成却基本未受影响。在此，我们对两名经长期拉米夫定干预治疗的患者进行研究，探讨无明显复制期HBV血清核酸标志物。
　　方法：自两名HBV表面抗原(HBsAg)和E抗原（HBeAg）阳性、经长期拉米夫定干预治疗的HBV慢性感染患者血清中提取核酸，采用本实验已建立的方法，经PCR定量HBVX区、C区、preC区DNA及相应的RNA，将全长型RNA(FulllengthRNA,fRNA)和顿挫型RNA（Truncated RNA,trRNA）作为poly(A)RNA测定，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳显示结果，Southern-blotting验证反应的特异性。
　　结果：患者1的病毒DNA分别在12个月（XDNA）、9个月（CDNA）、8个月（PreCDNA）内从109·mL-1下降为103·mL-1。各自RNA片段的减少也表现为相似的动力学。然而在早期的时间点，RNA的拷贝数要比相应的DNA低（106－107）。在第6个月，患者1被检测出形成YVDD突变。在第16、17和18个月，仅见X区DNA和RNA早期反跳和连续性下降。从第19，20，21个月开始，X，C和PreCDNA各自表现为稳步增长。相应的X，C和PreCRNA片段的拷贝数也遵循类似的模式，却未达到各自DNA片段的水平。也就是说，它们没有达到开始拉米夫定治疗时的水平。检测Poly(A)RNA（即fRNA和trRNA）来测定病毒DNA的转录活性，全长型RNA的消失和反跳与所观察到的DNA片段类似。与fRNA相比，顿挫型RNA持续时间更为长久，且其更早再现。肝损伤标志物ALT和AST的模式与病毒核酸的消失与重现平行。
　　患者2未出现YMDD突变。鉴于6个月未查到病毒复制标志物，在对其进行拉米夫定治疗20个月后停药。在第24个月，由于ALT/AST重新上升，为改善肝功能[121]，对其采用混合中草药提取物治疗。由于HBeAg在第27个月重新出现，采用中草药＋干扰素2α到第30个月，未见明显效果。因此，重新对其开始拉米夫定治疗，并被证明有效。患者2的DNA和RNA与患者1有相似的表现。在病毒复制反跳期间，trRNA较fRNA存在更久、且出现更早。与患者1类似，其HBeAg与ALT/AST同病毒复制平行。
　　证实了阻断早期中间体的优先形成。由于出现抗药性突变（患者1）和不连续的治疗（患者2），两名患者均可见到病毒复制迅速反跳。fRNA随PreCDNA、trRNA随XDNA水平变化，在治疗后期的某些时间点，trRNA是唯一出现的poly(A)病毒RNA。
　　结论：HBVX-DNA是早期检测拉米夫定治疗中耐药性发展的血清标志物，监控完全抑制HBV复制的PCR方法必须以X基因区为靶点。此外，在无HBV复制期，应将trRNA作为HBV表达的标志物。

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前言

文献回顾

1. HBV 研究现状

2. HBV 基因组

3. HBV 基因组复制

4. HBV 基因组转录

5. HBV 感染过程

6. 病毒蛋白及其意义

7 HBV 基因型

8. HBV 的变异

9 HBV 的传播途径

正文

引言

实验

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢