CaMKⅡ对热休克小鼠胚胎成纤维细胞HSP70表达的影响

摘要

生物机体在热应激（或者其他应激）状态下所表现的以基因表达变化为特征的防御适应反应称为热休克反应(heatshockresponse,HSR)。而在热应激（或其他应激）时新合成或者合成增多的一组蛋白质称为热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)。热休克反应也具有应激反应的基本特征,即非特异性和防御适应性。热休克反应是细胞应激反应的一种。
　　 热休克蛋白70(Heatshockprotein70,HSP70)是机体在应激情况下迅速合成的一种蛋白质,并参与细胞耐热力的形成。当动物细胞处于热休克状态时,HSF1通过一系列复杂的机制活化,从而诱导HSP70基因的转录。Ca2+/CaM依赖性激酶系统(CaMK),是Ca2+信号传递过程中的关键性激酶。它们通过调节基因转录而最终发挥信号对机体的调节作用。Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶包括CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ。其中,CaMKⅠ和CaMKⅣ受钙调蛋白激酶激酶(CaMKK)的激活,而CaMKⅡ则直接被Ca2+/CaM激活。作为钙信号下游的一种多功能丝/苏氨酸蛋白激酶,CaMKⅡ在生物的基因表达调控中发挥重要功能。近年来,热休克信号传导以及诱导热休克基因表达,使生物产生耐热性的机制是人们研究的热点问题。如果能证实CaMKⅡ参与小鼠胚胎成纤维细胞热休克信号转导,即可为进一步研究热休克基因的表达及动物耐热的机理奠定基础。
　　 动物细胞的热休克感应是一个多基因控制的复杂过程,MEF受热时CaMKⅡ是否表达,以及其是否参与热激信号转导,目前在国内外文献资料中均未见报道。本试验以小鼠成纤维细胞(MouseEmbryonicFibroblasts,MEF)为试验对象,主要研究热休克条件下HSP70、HSF1和CaMKⅡ的表达情况,揭示CaMKⅡ在热休克反应中的的作用及其机理。
　　 将体外培养的小鼠胎儿成纤维细胞(MouseEmbryonicFibroblasts,MEF)随机分为39℃和41℃热处理组(分别处理0.5h、1h、1.5h和2h)和常温对照组(37℃),测定各组细胞CaMKⅡ和HSF1及其mRNA的量。根据以上试验的结果将MEF分为37℃和39℃CaMKⅡ特异性抑制剂(myr-AIP)处理组和相应的空白对照组,分别测定各组细胞HSP70、HSF1及其mRNA的量。
　　 39℃热休克0.5h至2hCaMKⅡ的表达量均显著高于常温对照组(P＜0.05),39℃热休克1h组细胞CaMKⅡ的表达量极显著(P＜0.01)高于其他各组,41℃热休克0.5h和1h时,显著(P＜0.05)高于其他各组;39℃热休克0.5h至2h时,HSF1的表达量较常温对照组增加极显著(P＜0.01),41℃热休克1h时,HSF1表达量显著(P＜0.05)高于其他各组。适当的热休克作用可以使HSF1和CaMKⅡ的mRNA转录增加,且39℃处理1h能够显著诱导CaMKⅡ和HSF1基因转录。Myr-AIP处理MEF1h后,加入和未加入myr-AIP组的MEF细胞于37℃培养时,其HSF1及HSP70的mRNA表达量差异均不显著,而小鼠胚胎成纤维细胞在37℃和39℃热休克条件下培养时,加入和未加入myr-AIP两组细胞之间,其HSF1的mRNA表达量依然没有明显差异,说明myr-AIP对HSF1的转录没有影响。37℃未加myr-AIP组和加入myr-AIP组HSP70表达量差异不显著,而经过39℃热休克处理的细胞,未加myr-AIP组的HSP70表达量极显著(P＜0.01)高于加入myr-AIP组HSP70表达量。在37℃培养时,各组细胞无论是否加入myr-AIP,三种检测的蛋白均没有显著差异。在39℃培养时,myr-AIP处理的细胞,HSP70的蛋白表达量显著(P＜0.05)低于没有经过myr-AIP处理组的细胞,HSF1的蛋白表达量没有显著差异,而p-HSF1(ser230位点磷酸化)的蛋白表达量极显著(P＜0.01)低于未加入myr-AIP的组。即myr-AIP抑制了热应激处理组HSP70的转录及翻译,但并不是通过HSF1的mRNA转录水平变化影响的。
　　 以上结果说明,适当的热休克作用可以使HSP70、HSF1和CaMKⅡ的mRNA转录增加,且39℃处理1h能够显著诱导CaMKⅡ和HSF1基因转录。MEF培养液中添加Myr-AIP可以显著抑制HSP70和p-HSF1的表达。CaMKⅡ参与热休克反应,并通过p-HSF1诱导HSP70基因表达。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第一章 文献综述

1 综述前言

2 热休克蛋白70概述

3 HSF1活性与功能的反馈调控

3．1 Hsps和分子伴侣对HSF1三聚化具有抑制作用

3．2 磷酸化对HSF1转录活性的调控

4 热应激诱导的热休克蛋白70表达对细胞的保护作用

4．1 分子伴侣功能

4．2 诱导热耐受性

4．3 抑制细胞凋亡

4．4 抵抗氧化应激

4．5 参与细胞增殖

第二章 热休克对小鼠胚胎成纤维细胞HSF1和CaMK Ⅱ表达的影响

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 试验试剂

1．3 试验仪器

2 试验方法

2．1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备和培养

2．2 试验分组

2．3 RT-PCR检测MEF的HSF1和CaMK Ⅱ基因表达量

2．4 Western blot检测细胞HSP70、HSF1和CaMK Ⅱ的蛋白表达水平

2．5 统计学处理

3 结果

3．1 热休克对CaMK Ⅱ和HSF1 mRNA表达的影响

3．2 热休克对CaMK Ⅱ和HSF1蛋白量的影响

4 讨论

第三章 CaMK Ⅱ参与热休克HSP70的诱导合成

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 试验试剂

1．3 试验仪器

2 试验方法

2．1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备和培养

2．2 试验分组

2．3 RT-PCR检测MEF HSP70和HSF1基因表达量

2．4 Western blot检测细胞HSP70和HSF1的蛋白表达水平

2．5 统计学处理

3 结果

3．1 Myr-AIP对HSF1和HSP70 mRNA的影响

3．2 Myr-AIP对HSF1和HSP70蛋白表达的影响

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文