牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞的生物学效应

摘要

近年来，牙周病与心血管疾病的关系逐渐受到人们的重视，流行病学研究表明牙周病与心血管疾病密切相关，牙周病可能是动脉粥样硬化的危险因素之一。动脉粥样硬化是一种波及大、中型血管的疾病，现在普遍认为免疫反应和炎症反应在动脉粥样硬化的发生和发展中起一定作用。近期研究表明，冠心病的发生发展机制与感染引发的免疫反应密切相关。牙周病是人类最常见的感染性疾病之一，其导致的局部和全身免疫反应目前已被认为是发病的主要病理机制。大量的流行病学调查资料表明，冠心病和外周动脉粥样硬化的患者口腔卫生不良率和牙周炎患病率均较高。基础研究已经显示，脂多糖-单核细胞-细胞因子（前列腺素E2、血栓素A2、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α）之间的相互作用可能是牙周炎和动脉粥样硬化相互联系的生物学基础。因此，本研究旨在从细胞生物学的角度入手，通过培养人脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs），与牙龈卟啉单胞菌（Porphysomanasgingivalis,P.g）共同孵育，观察牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞生物学活性的影响和分析关键细胞因子含量的变化，从而为牙周炎与冠心病之间的相关发病机制提供佐证。
　　方法：经消化法培养获得人脐静脉血管内皮细胞，厌氧培养获得牙龈卟啉单胞菌，通过MTT法检测牙龈卟啉单胞菌对血管内皮细胞增殖的影响，凋亡试剂盒检测牙龈卟啉单胞菌对血管内皮细胞凋亡的影响，扫描电镜和透射电镜观察牙龈卟啉单胞菌对血管内皮细胞结构的影响。ELISA法检测牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞分泌IL-18和CRP的影响。
　　结果：1．P.g和大肠杆菌LPS均能抑制HUVECs的增殖（P＜0.02），且P.g对HUVECs的抑制作用较大肠杆菌LPS更为明显（P＜0.05）。P.g感染HUVECs3h后即可见部分细胞黏附性下降，极少部分细胞开始脱落固缩。随着时间的延长，这种作用更加明显，24h后凋亡检测显示，正常细胞组单个高倍视野下见一个或是无细胞凋亡，平均凋亡率＜2％。而P.g感染组可见部分细胞凋亡，计算三个高倍视野，细胞平均凋亡率为20％左右。通过扫描电镜和透射电镜对P.g侵入HUVECs的观察显示，P.g的主要菌毛在侵袭和黏附内皮细胞过程中起重要作用，P.g通过胞吞途径实现对内皮细胞的侵入。
　　2．HUVECs自身表达少量的IL-18和C反应蛋白；P.g剂量依赖性增强HUVECs产生IL-18蛋白和C反应蛋白的水平，IL-18蛋白水平和C反应蛋白的水平在P.g刺激后的4h开始增加，在8h、12h和24h继续增加，且相同浓度作用下HUVECs分泌CRP的量明显高于其分泌IL-18的量。P.gATCC33277、P.g381均可以诱导HUVECs分泌IL-18、CRP，其分泌的量明显高于空白对照组(P＜0.05)，但P.gATCC33277、P.g381之间诱导分泌的量无明显差别。
　　结论：P.g能明显抑制HUVECs的增殖，增加HUVECs的凋亡；P.g可能通过胞吞途径实现对内皮细胞的侵入。P.g剂量和时间依赖性增强HUVECs表达IL-18和CRP。P.g对HUVECs的作用可能在心血管疾病病理反应中有重要意义。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

流行病学研究

病理机制研究

细胞因子的功能及相互联系

正文

实验一 人脐静脉血管内皮细胞体外培养及生物学活性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 牙龈卟啉单胞菌的培养和鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 牙龈卟啉单胞菌对血管内皮细胞生物学活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞产生IL-18 和 C 反应蛋白的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢