姜黄素对肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护性实验研究

摘要

研究背景：
　　现代研究表明，动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一个慢性损伤性炎症反应。血管内皮细胞功能障碍是其形成的早期病变，并且参与AS发生发展的全过程。因此，预防及修复血管内皮细胞损伤，保护其结构和功能的完整性具有重要意义。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的炎症因子，它不仅对细胞具有直接毒性作用，而且通过产生趋化因子（chemotatic factor）、诱导细胞粘附分子（cell adhesion molecule，CAM）表达以及诱导核转录因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）活化等多种途径导致血管内皮细胞的损伤。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chermtach protein-1，MCP-1)是单核∕巨噬细胞特异的趋化性因子，它可加速单核细胞迁移过程，使之与血管内皮细胞粘附的单核细胞容易通过内皮间隙迁移至内皮下，最终导致AS性脂质条纹的形成。其表达增加常与NF-κB的活化相关并受其调控。NF-κB是一类参与炎症过程中多种信号转导途径的核转录因子，在AS的炎症反应中起重要作用。如何抑制这些致炎因子的活性，逆转TNF对内皮细胞的炎性损伤成为人们关注的新热点。姜黄素是中药姜黄的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，尤其在保护内皮细胞、治疗心血管疾病方面具有重要意义。尽管如此，姜黄素发挥逆转内皮细胞损伤作用的具体机制目前尚不清楚。因此，本实验采用TNF-α体外诱导人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），建立细胞损伤模型，观察姜黄素对其保护作用，并进一步探讨其可能作用机制。
　　研究目的：
　　1、原代培养人HUVEC，用TNF-α实施干预，模拟体内炎症造成的内皮细胞损伤模型，观察不同浓度的姜黄素作用后对内皮细胞受到损伤的改善作用。
　　2、观察细胞核和细胞浆中NF-κB的表达、分布情况，同时观察姜黄素是否能够降低其表达。
　　3、检测细胞上清液中MCP-1的表达，初步探究姜黄素保护HUVEC损伤的机制。
　　研究方法：
　　1、细胞培养：采用酶消化法原代培养HUVEC，用免疫组化法对其进行第Ⅷ因子辣根过氧化物酶染色；MTT法确定TNF-α建立细胞损伤模型的最佳浓度；同时检测姜黄素对HUVEC活性的影响。
　　2、MTT法检测HUVEC细胞生长抑制率。
　　3、采用免疫细胞化学法检测正常对照组、TNF-α组和不同浓度姜黄素组中NF-κB表达的情况。
　　4、用ELISA法检测正常对照组、TNF-α组和不同浓度姜黄素组细胞上清液中MCP-1的蛋白含量，用RT-PCR法检测MCP-1mRNA的表达水平。
　　研究结果：
　　1、原代培养的HUVEC细胞在48h后可见大量贴壁，最初贴壁细胞呈多角形、石块状或成团聚集，后逐渐伸展成长梭形，细胞体积增大，胞浆丰富，第Ⅷ因子染色呈阳性。
　　2、MTT检测显示，当TNF-a浓度为10ng/L时，HUVEC细胞受到的损伤最为严重，因此该浓度为建立细胞损伤模型的最佳浓度。
　　3、MTT法检测HUVEC细胞生长抑制率显示，TNF-a模型组中细胞抑制率明显高于对照组（P<0.01）；TNF-a＋姜黄素（12.5，25，50和100μg/mL）组的细胞抑制率比TNF-a模型组明显降低（P<0.01）且呈现出浓度依赖趋势。
　　4、免疫组化染色结果显示在正常的HUVEC胞浆中NF-κB有一定程度的表达，核内不表达；当加入TNF-α后，NF-κB表达强度增加，表现为胞浆内棕黄色染色加深，且呈现部分核内表达，阳性细胞数目增多；当加入姜黄素干预后，可以减少NF-κB的表达，低浓度时改善作用不明显，但随着浓度升高，抑制作用逐渐加强，阳性细胞数目随之减少。
　　5、ELISA法检测显示，与对照组相比，模型组MCP-1表达明显增加（P<0.01）；而不同浓度姜黄素作用后，与模型组相比可明显抑制TNF-a诱导的MCP-1表达（P<0.01）且呈现出浓度依赖趋势，但与对照组相比在低浓度时表达下降不明显。
　　6、RT-PCR法检测HUVEC细胞在模型组和姜黄素组中β-acting基因的表达产物几乎保持不变，但目的基因表达产物在TNF-α组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少（P<0.01）。
　　研究结论：
　　姜黄素能缓解TNF-α对HUVEC造成的炎性损伤，可能通过以下途径：
　　1、直接减轻TNF-α对内皮细胞的细胞毒作用；
　　2、通过抑制NF-κB的活化，下调MCP-1的表达，从而阻止细胞进一步损伤。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 祖国医学对AS的认识

二 现代医学对AS发病机制的认识

三 姜黄素的研究概况

正文

第一部分 HUVEC的原代培养及损伤模型的建立

材料与方法

结果

讨论

第二部分 姜黄素对肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞中表达核转录因子-κB的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分 姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞中单核细胞趋化蛋白-1 表达的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢