脊髓爆震伤的病理特征及热休克蛋白70对脊髓的保护作用

摘要

随着武器装备的现代化以及高科技战争条件下战略战术的转变，各国军队的远程打击能力及爆炸性武器威力都大大提高，精确制导的大规模杀伤性武器越来越多的用于战场，战场上爆炸冲击伤的数量明显增加。脊髓作为中枢神经系统一旦受损，轻者影响战斗力，重者导致截瘫甚至死亡，特别是脊髓截瘫患者伤后护理困难、费用高昂、极易罹患各类并发症，因此脊柱、脊髓战伤已经成为各国相关部门研究的热点。
　　以往，中枢神经系统特别是脊柱、脊髓火器伤的研究重点集中在枪弹贯通伤，但是随着各国单兵保护装备的不断更新和恐怖主义活动的增加，单纯的枪弹贯通伤数量明显减少，而爆炸冲击伤明显增加。本课题在以往脊柱脊髓爆震性损伤动物模型的基础上，利用已申请国家实用新型专利的多功能全自动压力冲击仪（专利申请号200820030390.7）建立神经细胞冲击损伤模型，从细胞水平研究脊髓爆震伤的损伤机制，初步探讨脊髓爆震伤后的早期救治，以期为临床针对性治疗脊髓爆震伤提供实验依据。
　　第一部分：脊髓爆震伤动物模型的建立及相关研究
　　1.脊髓爆震伤动物模型的改进及病理变化研究。针对脊髓在冲击损伤后的一系列病理变化，我们建立可控性脊髓爆震伤动物模型，选择3gC4混合军用炸药球作为爆源，完全排除了弹片的干扰，保证实验结果良好的可重复性和脊髓损伤单纯的冲击性。对实验动物脑及胸腹脏器加以妥善保护后，背部平肩胛下角平面的胸腰段脊柱暴露于爆源正下方，电控引爆。实验中选取1、2、3、4cm的爆炸距离进行实验，通过观测不同爆炸距离的实验动物致伤情况，选择适当的爆炸距离作为动物模型的建立参数。最终选择4cm的爆炸距离作为脊髓爆震伤动物模型的标准爆炸距离。然后，通过病理组织切片和透射电镜技术对脊髓爆震伤后的病理变化进行系统的观察。结果证实：
　　①动物冲击伤的死亡原因主要是体内重要脏器的挫伤、出血；在脏器损伤中肺部的挫伤最为常见，也是死亡的首要原因。爆炸源为3gC4混合军用炸药球，4cm爆炸距离制作的脊髓爆震伤模型的可控性、重复性好，动物成活率高，未造成脊柱骨折，单纯冲击因素致伤的特点，为脊髓爆震伤的研究奠定了实验基础。
　　②脊髓爆震伤标本表面可见出血及椎管内血管的凝血，由此而造成了脊髓的缺血性损伤，是脊髓继发性损伤的主要因素之一。从病理切片上看，损伤主要是神经元细胞核浓聚、偏位甚至破裂，尼氏小体消失，白质结构异常，髓鞘板层结构松散甚至崩解，并可见组织出血，及血管内瘀血、血栓形成。
　　③透射电镜的观察爆震伤脊髓主要是白质的脱髓鞘改变，髓鞘结构松散、断裂，有空泡形成；线粒体肿胀，微丝“漂浮”于胞质中，核呈“孤岛”，内质网明显扩张呈大泡，皱襞断裂，核内胞质浓聚。
　　2.脊髓爆震伤与机械性损伤的病理对照研究。对比研究了脊髓爆震伤与机械性脊髓损伤的病理特点。机械性损伤模型选用了Allen氏脊髓损伤法（20g重物10cm）。在损伤后脊髓标本HE染色的基础上，进一步采用Tunel染色的方法观察伤后6h、12h和24h两种损伤后组织细胞的凋亡情况，DNAladder分析了爆震伤脊髓凋亡的情况。通过透射电子显微镜对比观察脊髓组织的超微结构。最后运用BBB评分方法对比两种脊髓损伤动物的神经功能恢复情况。结果证实：机械性脊髓损伤范围局限，局部出血、淤血较严重，损伤节段大量脊髓神经元变性呈不可逆改变；爆震性损伤累及脊髓节段范围广，于未损伤节段亦可检测出细胞凋亡发生，神经元坏死发展迅速；电镜下表现出结构和细胞器毁损更严重。
　　3.热休克蛋白70对动物脊髓爆震损伤的保护性研究。观察了热休克蛋白（HSP70）对爆震伤脊髓的保护作用：采用免疫组化的方法检测脊髓爆震伤动物模型损伤后组织中HSP70的表达情况。与单纯爆震损伤的对照组对比观察热休克预处理的动物脊髓神经细胞凋亡的情况。然后，利用行为学评分的方法，比较热休克预处理组与对照组神经功能恢复的情况。结果证实：HSP70在爆震冲击后在动物的脊髓组织内表达量较少，这可能与组织受到爆震冲击时发生严重损伤，没有时间产生热休克蛋白有关；经热休克预处理的脊髓组织可以大量表达HSP70，对脊髓组织细胞的凋亡有明显的抑制作用，对爆震伤后动物的脊髓起到保护作用。
　　第二部分：细胞冲击伤模型的建立及相关损伤机制研究
　　PC12细胞冲击损伤模型的建立及病理机制研究。使用本课题中研制的全自动压力损伤仪对PC12细胞体外冲击加载压力，观察细胞的活性及增殖情况。根据细胞MTT结果，确定0.5Mpa,10min为压力损伤参数建立PC12细胞的体外压力损伤模型。进一步运用免疫组化、流式细胞仪、透射电子显微镜等方法研究其病理变化，结果证实：
　　①细胞的活性及增殖受到压力损伤的影响，随压力的增高，细胞的增殖减慢，较高的压力时（0.7Mpa），细胞大多数死亡；在0.5Mpa是细胞多数表现出凋亡的发生。
　　②机械性损伤对细胞骨架结构有破坏作用，导致细胞凋亡，凋亡的发生与细胞微管结构的破坏时程相一致。并且病程发生早，发展迅速，这些病理特点提示爆震冲击性损伤以损伤骨架结构为基础。
　　鉴于以上实验结果，说明脊髓的爆震冲击伤不同于一般的机械压迫性损伤，伤情更复杂，发病早且范围更广；冲击震荡对脊髓细胞的骨架结构影响较大，且凋亡发生早。这些发现促使我们更深入研究冲击性损伤细胞骨架结构的病变过程，为我们在损伤早期干预，减轻脊髓损伤奠定实验基础。

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前言

文献回顾

脊柱脊髓火器伤的研究现状

脊髓损伤的研究现状

正文

第一部分 爆震伤动物模型的建立及相关研究

实验一 脊髓爆震伤动物模型的改进及伤情分析

实验二 脊髓爆震伤的病理变化研究

实验三 脊髓爆震伤与机械性损伤的病理对照研究

实验四 热休克蛋白 70 对动物脊髓爆震损伤的保护作用

第二部分 细胞冲击损伤模型的建立及相关损伤机制研究

实验一 冲击损伤 PC12 细胞模型的建立

实验二 PC12 细胞冲击损伤的病理机制研究

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢