同种异体骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤的实验研究

摘要

1.骨髓间充质干细胞与角膜缘上皮细胞的体外培养与鉴定
　　骨髓间充质干细胞在10％FBS的DMEM培养基中培养，角膜缘上皮细胞在EpiLife?培养基、含激素和5％FBS的D/F12培养基、低钙的KSFM培养基中分别培养。将培养的MSCs进行体外成脂和成骨诱导，以鉴定MSCs（这种经过诱导的MSCs不用于体内移植）。RT-PCR和免疫细胞化学染色检测LECs中角膜缘干细胞、角膜上皮瞬时扩增细胞、角膜上皮终末分化细胞的表达：ABCG2、PCNA、CX43、CK3、CK12。
　　体外结果表明，MSCs与LECs原代培养24小时贴壁，7天铺满，MSCs为成纤维样生长，LECs呈上皮样生长。油红和茜素红染色阳性表示MSCs的成脂和成骨分化能力。RT-PCR检测培养的LECs中有角膜缘干细胞ABCG2、瞬时扩增细胞CX43、终末分化细胞CK3/12表达。免疫细胞化学染色同样证实了LECs中有角膜缘干细胞ABCG2表达，以及细胞增殖性标志物PCNA表达。
　　体外培养了移植用的MSCs与LECs。MSCs经过诱导，向成脂和成骨分化。培养的LECs中有具有克隆扩增能力的角膜缘干细胞成分。
　　2.脱细胞角膜材料的制备与生物学测量
　　取新鲜角膜，制备DPC：-80℃冻30分钟，解冻后4℃蒸馏水溶胀12-18小时，切取前板层角膜片，室温下0.25％胰酶消化30分钟，1mol/LNaOH浸泡2小时，40U/mlDNA/RNA酶处理30分钟，振荡洗涤，37℃10％海藻糖浸泡2小时，-80℃预冻1小时，冷冻干燥机冻干16小时，60Co照射消毒。
　　将DPC、人羊膜（HAM）、兔角膜（RC）复水，测量3种材料的光学特性和机械强度。阿贝折射仪测量折射率，PE分光光度计测量透射率，小型英斯特朗仪测量抗拉强度和弹性模量。
　　DPC的折射率是1.3313，HAM是1.3322，RC是1.3340。DPC的透射率是50％,HAM是70％,RC是92％。DPC的抗拉强度是2.4MPa，HAM是3.6MPa，RC是4.5MPa。DPC的弹性模量是3.8MPa，HAM是0.78MPa,RC是5.3MPa。
　　结果表明，脱去了细胞成分的角膜材料有与羊膜相似的光学特性和机械强度。
　　3.骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤
　　MSCs和LECs标记PKH26后接种于DPC材料表面，体外培养MSCs-DPC植片与LECs-DPC植片。麻醉兔，将浸泡过1mol/LNaOH的滤纸置于角膜表面，诱发新生血管后角膜随机分为4组：MSCs-DPC移植组，LECs-DPC移植组，DPC移植组，碱烧伤组（不做移植）。在碱烧伤角膜上制作板层植床，分别将MSCs-DPC、LECs-DPC、DPC植片缝合于受损植床，术后，细胞移植组的眼表覆盖软性接触镜，LECs移植组给与0.3％地塞米松、1％环孢霉素A滴眼液点眼。
　　连续随访4个月，从角膜透明度、新生血管、存活率方面观察MSCs-DPC移植后碱烧伤角膜的愈合情况并评分。移植后4个月内，对移植组和碱烧伤组角膜进行取材、固定、包埋、切片。做HE染色、Masson三色染色、PKH26示踪检查，同时检测MSCs移植后是否转分化表达角膜上皮标志物。透射电镜超薄切片染色观察细胞连接。MSCs移植后5周内收集移植组和碱烧伤组的角膜，RealTimePCR测定MIP-2的表达。
　　临床观察表明，在MSCs-DPC移植组和LECs-DPC移植组，角膜能较快恢复透明，而且新生血管较少。在第1个月，未接受移植的碱烧伤角膜呈现广泛的混浊水肿和新生血管；相比之下，MSCs-DPC和LECs-DPC移植后角膜的炎性混浊和新生血管化程度均明显减轻。在第4个月，MSCs移植组的角膜恢复了透明和无血管化；而碱烧伤组的角膜形成了瘢痕和血管翳；在DPC单独移植组，4个月后角膜中央区仍有白斑。
　　统计学分析表明，MSCs移植组和给药的LECs移植组的角膜透明度和无血管化恢复较快，而且更长时间保持角膜透明。
　　在第2个月，MSCs移植组和LECs移植组的角膜表面都检测到了PKH26表达。在MSCs组的PKH26阳性位点，没有检测到CK3/12表达。这表明MSCs移植后存活于角膜表面，但并没有转分化为上皮细胞。
　　为了验证临床结果，我们观察了MSCs-DPC移植到碱烧伤角膜后角膜愈合的组织病理过程。在MSCs移植后第1个月，HE和MassonTrichrome染色能清楚地观察到前板层角膜中的DPC纤维和新生的胶原纤维，炎性细胞浸润和新生血管局限在板层植片周围，植片表面被覆3-4层细胞。同样在第1个月，碱烧伤组的角膜水肿变厚，炎性细胞浸润和新生血管广泛。在MSCs移植到碱烧伤角膜后第2-3个月，DPC大部分降解，有新生组织形成，而且，碱烧伤角膜的炎性细胞浸润和新生血管明显消退，这时仍能在周围的角膜植床中分辨出板层植片。到MSCs移植后第4个月，角膜中没有观察到炎性细胞浸润和新生血管，DPC纤维完全降解，新生的胶原组织在空间排列上更加有序，与周围植床融合，类似于周围角膜基质的胶原构象。
　　在第4个月，透射电镜观察到MSCs-DPC移植处角膜表面的细胞间形成桥粒结构，细胞与基质间形成半桥粒结构。
　　实验初步观察到在MSCs移植后3-5周碱烧伤角膜的MIP-2表达下调。
　　本实验表明同种异体骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植可以修复兔角膜碱烧伤，脱细胞角膜材料可以作为有一定厚度的组织工程支架材料用于角膜损伤修复的研究。4个月的临床观察、统计学分析、组织病理学结果表明，与传统给药的角膜缘上皮细胞移植相比，MSCs移植可以重建碱烧伤角膜的透明度，减少新生血管，延长角膜的透明时间。MSCs移植对兔角膜碱烧伤的治疗作用可能与MSCs减轻炎症的作用有关。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

一、骨髓间充质干细胞在细胞移植及角膜重建中的应用

二、脱细胞角膜材料

三、角膜缘干细胞移植

四、应用组织工程技术重建角膜上皮

正 文

实验一 骨髓间充质干细胞与角膜缘上皮细胞的培养与鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验二 脱细胞角膜的制备与生物学测量

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验三 骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤

1.材料和方法

2 结果

3 讨论

小 结

参考文献

附图

个人简历和研究成果

致谢