鹿重组PrPc蛋白单克隆抗体的制备及CWD免疫组织化学检测方法的建立

摘要

传染性海绵状脑病（Transmissiblespongiformencephalopathy,TSE）是一种重要的人畜共患病，主要的感染动物包括羊、牛、水貂及一些鹿科动物。鹿的TSE称为鹿慢性消耗性疾病(ChronicWastingDisease，CWD)。TSE的病原是一种由体内正常的朊蛋白(PrPc)转化成的朊毒体(PrPsc)。目前检测该病较为有效的方法是免疫组化，组织切片经蛋白酶K消化后，PrPc被完全消化，而PrPsc的核心片段能抵抗蛋白酶K消化保留了下来，由于PrPc和PrPsc的一级结构相同，制备PrPc核心片段的单抗就可以用于CWD的免疫学检测。
　　 本试验在已经获得PrPc阳性重组质粒EPrP-pET-32a(+)的基础上，将其转化E.coliBL21(DE3)，挑取阳性克隆培养，IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析，出现大小约27-30KD的表达产物。重组蛋白纯化后经Westernblotting分析，表明该蛋白具有较好的反应原性。通过摸索不同诱导时间、温度和不同IPTG浓度优化了重组蛋白的表达条件:用含100mM氨苄的LB培养基在37℃振摇培养，待菌生长至OD值0.6时，用终浓度为1.0mM的IPTG诱导，于37℃振荡培养6h。E.coliBL21(DE3)表达菌超声波裂解离心后，上清和沉淀电泳，结果表明，蛋白几乎全部存在于包涵体内。经超声波裂解菌体后，分离包涵体并离心、洗涤，再用8M尿素溶解包涵体，最后用试剂盒纯化经变性处理的融合蛋白。
　　 以原核表达并纯化的PrPc重组蛋白为免疫原，按常规方法免疫PrPc基因敲除小鼠，细胞融合前经反复试验，确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件。即:表达的抗原用PBS以1∶1000倍稀释，以1∶1000稀释的阴、阳性血清分别作为阴、阳性对照，反应条件均为37℃、60min。取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经2次有限稀释法克隆，最终获得5株持续且稳定分泌抗PrPc蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为:5A5、3B2、6D12、5E3、1F5。利用这5株杂交瘤细胞株，建立和优化了CWD的免疫组织化学（Iimmunohistochemistry,IHC）诊断方法。试验结果表明，5株单抗中只有5E3和3B2可以与CWD的阳性鹿延髓切片发生特异性免疫反应，而且5E3的反应较强烈，3B2的反应较弱，其他三株单抗则在试验的浓度范围内无特异性免疫反应。此外，5E3的稀释比例为1∶10000时，免疫反应效果达到最佳状态。试验结果表明，单抗5E3可以用于我国CWD的监测。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 传染性海绵状脑病研究概况

1．1 前言

1．2 病原

2 诊断

2．1 临床诊断

2．2 实验室诊断

2．3 免疫学检测

2．4 其他检测方法

3 CWD的研究进展

3．1 传染来源

3．2 传播途径

3．3 易感动物

3．4 流行特征

3．5 发生与分布

4 防控措施

第二章 试验部分

试验一 抗鹿PrPc成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

试验二 单抗介导CWD免疫组织化学检测方法的建立与优化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

符号及缩略语

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文