舒洛地特对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质积聚的影响及其机制研究

摘要

糖尿病肾病是糖尿病患者严重的并发症，也是终末期肾功能衰竭最常见的病因。但是目前糖尿病肾病尚无有效的治疗方法，因此，寻找糖尿病肾病的有效治疗途径，一直是肾脏病领域亟待解决的重要课题。既往研究证实，舒洛地特可以降低糖尿病肾病的尿蛋白，对肾脏起到保护作用，但舒洛地特的肾脏保护机制仅存在几种假说，确切机制不明。糖尿病肾病主要病理变化包括肾小球肥大，肾小球细胞外基质积聚，肾小球基底膜增厚和肾小球硬化。其中肾小球细胞外基质积聚在肾小球硬化的发生、发展中起着至关重要的作用。那么，舒洛地特是否能通过抑制肾小球细胞外基质积聚而起到肾脏保护作用，目前尚未见相关报道。因此，我们建立糖尿病大鼠模型，然后在此基础上研究舒洛地特对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质积聚的影响，并探讨其分子机制。
　　目的：建立2型糖尿病大鼠模型，观察舒洛地特对糖尿病大鼠肾损害的保护作用及对肾小球细胞外基质积聚的影响，初步探讨舒洛地特抑制糖尿病大鼠肾小球细胞外基质积聚的分子机制。
　　方法：首先从SD大鼠中随机取出10只，设为正常对照组(C组)。其余50只大鼠予以高脂、高糖饲料喂养1个月后，腹腔注射链脲佐菌素造模。将造模成功的40只大鼠随机分为糖尿病模型组(DM组)、不同剂量的舒洛地特治疗组(DMS1组、DMS2组)和替米沙坦治疗组(DMT组)，分别给予5mg/kg/d、10mg/kg/d舒洛地特肌肉注射和5mg/kg/d替米沙坦水溶液灌胃治疗。治疗8周后观察24h尿白蛋白定量、肾脏肥大指数、血糖、糖化血红蛋白、血尿素氮及血肌酐的变化；光镜及电镜下观察肾组织病理学改变；并通过免疫组织化学法及Westernblot观察肾组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的变化。
　　结果：
　　1．实验室检测：治疗结束时(8周)，大鼠24h尿白蛋白定量、肾脏肥大指数在DM组显著升高(P<0.01)，各治疗组显著下降，其中以DMS2组和DMT组下降最为显著(P<0.05或P<0.01)，但仍高于C组，而二者之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠血糖、糖化血红蛋白水平在DM组显著升高(P<0.01)；各治疗组无明显下降(P>0.05)。各组大鼠血尿素氮水平均无明显升高(P>0.05)。大鼠血肌酐水平在DM组显著升高(P<0.01)；各治疗组血肌酐升高幅度低于DM组升高幅度，但差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　2．在光镜下，C组大鼠肾小球结构完整，未见肾小球增大及异常改变。DM组大鼠肾小球增大，系膜细胞、基质增生，系膜区增宽，毛细血管壁增厚。各治疗组肾组织的病理改变较DM组均有不同程度的减轻，其中以DMS2组、DMT组上述病变减轻明显。治疗8周时，大鼠肾小球面积、肾小球细胞外基质面积在DM组显著增加(P<0.01)；各治疗组显著减少(P<0.01)，其中以DMS2组、DMT组减少最为显著(P<0.05)，而二者之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。电镜下DM组可见肾小球基底膜弥漫或局限性增厚，系膜区增宽，足突融合、消失。各治疗组肾组织的病理变化较DM组均有不同程度的减轻，其中以DMS2组和DMT组上述病变减轻明显。
　　3．免疫组织化学染色结果显示，治疗结束时，大鼠肾组织中TGF-β1、CTGF、MMP-9、TIMP-1阳性面积比值在DM组明显增加，各治疗组明显减少，尤其TGF-β1、CTGF、TIMP-1在DMS2组和DMT组减少更为显著，但仍低于C组(P<0.01或P<0.05)；MMP-9阳性面积比值在各治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-9/TIMP-1的比值在DM组明显减少，各治疗组明显升高，尤其在DMS2组和DMT组升高更显著，但仍低于C组(P<0.01)。
　　4．Western blot结果显示，治疗结束时，大鼠肾组织中TGF-β1、CTGF、MMP-9、TIMP-1在DM组表达明显增加，各治疗组表达明显减少，尤其TGF-β1、CTGF、TIMP-1在DMS2组和DMT组表达减少更为显著，但仍低于C组(P<0.01)；MMP-9的表达在各治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-9/TIMP-1的比值在DM组明显减少，各治疗组明显升高，尤其在DMS2组和DMT组升高更显著，但仍低于C组(P<0.01或P<0.05)。
　　结论：
　　1．舒洛地特可以降低糖尿病大鼠尿中白蛋白排泄量，并呈现一定的量效关系，对肾脏具有保护作用，但这种肾脏保护作用与降低血糖无关。
　　2.舒洛地特可以降低糖尿病大鼠肾脏肥大指数，并减轻肾小球系膜区增宽、基底膜增厚及足突融合等病理学改变，提示舒洛地特可能通过抑制肾小球细胞外基质积聚，进而抑制肾小球硬化，起到肾脏的保护作用。
　　3.舒洛地特可以抑制糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1、CTGF的过表达，进而抑制肾小球细胞外基质过度积聚；改善MMP-9/TIMP-1比例失衡，提高MMP-9活性，加强肾小球细胞外基质降解。提示舒洛地特可能通过上述机制抑制糖尿病大鼠肾小球细胞外基质积聚，对肾脏起到保护作用。

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前 言

文献回顾

一 糖胺聚糖的特性及舒洛地特治疗糖尿病肾病的临床研究

1 糖胺聚糖的生物学特性及生理功能

2 舒洛地特的药物学特性

3 舒洛地特治疗糖尿病肾病的临床研究

4 舒洛地特的安全性

5 其他糖胺聚糖类药物治疗糖尿病肾病的临床研究

二 糖尿病肾病时肾小球细胞外基质积聚的分子机制

1 转化生长因子-β1 在肾小球细胞外基质积聚中的作用

2 结缔组织生长因子在肾小球细胞外基质积聚中的作用

3 基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂在肾小球细胞外基质积聚中的作用

4 类肝素蛋白聚糖在肾小球细胞外基质积聚中的作用

5 纤溶系统在肾小球细胞外基质积聚中的作用

6 一氧化氮在肾小球细胞外基质积聚中的作用

7 内皮素在肾小球细胞外基质积聚中的作用

8 胰岛素样生长因子在肾小球细胞外基质积聚中的作用

9 血小板衍化生长因子在肾小球细胞外基质积聚中的作用

三 糖胺聚糖对糖尿病肾脏保护机制的实验研究

正 文

实验一 舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏保护作用的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏组织形态学的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 舒洛地特抑制糖尿病大鼠肾小球细胞外基质积聚的分子学机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附 录

个人简历和研究成果

致谢