17β-雌二醇对大鼠心肌微血管内皮细胞的促血管新生作用及机制研究

摘要

研究背景和目的
　　冠心病（CHD）是严重威胁人类健康的疾病。目前,冠心病的治疗仍依赖于常规药物治疗、支架植入术及冠脉搭桥术等。虽然支架植入术及冠脉搭桥术与常规药物治疗相比已取得较满意效果，使部分CHD患者的临床症状和远期预后得到明显改善，但这些方法存在费用高昂、手术复杂、有危险性以及术后再狭窄等问题，且有相当多患者(20％～37％)因故不能做PTCA和
　　CABG。因此探索新的治疗方法和途径显得尤为重要。近l0年来，动物试验和临床试验已表明，治疗性血管新生治疗冠心病不啻为较有前途的新方法。治疗性血管新生（TherapeuticAngiogenesis）是指使缺血组织在原有微血管基础上形成新毛细血管，并与原有冠状血管网相交汇，在缺血的心肌区域架起新的血管桥，改善心肌供血的一种方法，系人为地通过各种方法提高病变部位血管新生诱导因子的浓度，促进局部血管新生（指由原已存在的毛细血管通过出芽或内填形成新的毛细血管），提高心肌血液供应代偿能力，最终达到治疗冠心病的目的。现有的治疗性血管新生治疗手段，主要包括应用生长因子直接注射或其基因转染，干细胞移植及药物治疗等。但生长因子的体内半衰期短和价格昂贵，并且还可能有某些潜在的严重毒副作用，加之受患者经济实力及基层条件的限制。用药物促进血管新生，刺激缺血区小血管生长，促进侧支循环形成，完成缺血区血管的自我搭桥便成了十分诱人的治疗方法。因此，深入研究血管新生的机制和开发有效的血管新生药物，成为目前治疗性血管新生的热点课题。众所周知内源性雌激素对女性有降低低密度脂蛋白、抗动脉粥样硬化、扩张血管等心脏保护作用，新近研究发现,17β-雌二醇（17β-E2）可加速脐静脉及牛主动脉内皮细胞的迁移和增殖,从而强化血管的生成效应。但有关17β-E2对心肌微血管内皮细胞（CMEC）的影响尚未见报道。因为不同组织器官的微血管内皮细胞存在差异，因此本实验以体外培养的大鼠CMEC为研究对象，观察17β-E2对大鼠CMEC的增殖、迁移、及管样结构形成的影响，从而为探讨17β-E2在冠心病中的应用提供实验基础及理论依据。
　　方法
　　第一部分：CMEC的分离培养及表型鉴定。
　　1．取SD雌性大鼠左心室，在75％乙醇中浸泡20s灭活心内、外膜大血管内皮细胞，以密度梯度离心及黏附细胞法分离出大鼠心肌微血管内皮细胞，在15％小牛血清DMEM培养基中培养，并定期观察；2．免疫荧光双染，鉴定细胞表型。
　　第二部分：大鼠CMEC雌激素受体（ER）表达的测定。
　　免疫荧光法检测雌性SD大鼠CMEC内是否有ER的表达。
　　第三部分：17β-雌二醇对大鼠心肌微血管内皮细胞的促血管新生作用及其机制研究。
　　1.取培养6天的细胞，分别给予不同浓度的17β-E2，MTT检测细胞增殖能力并选择最佳浓度。
　　2.用最佳浓度的17β-E2及17β-E2拮抗剂他莫昔芬进行以下实验：2.1细胞迁移实验检测17β-E2对细胞迁移能力的影响；2.2细胞侵入实验检测17β-E2对细胞侵入能力的影响；2.3管样结构形成实验检测17β-E2对细胞分化情况的影响；2.4ELISA法检测17β-E2对细胞分泌VEGF的影响。
　　统计学分析：数值均以±s表示。数据采用SPSS12.0统计软件包进行统计x分析，应用单因素方差分析进行统计学分析，有统计学意义的采用LSD-t检验进一步比较。
　　结果
　　1.CMEC免疫荧光染色可见VonWille-brand因子染色阳性,Dil-Ac-LDL吞噬实验呈阳性。证实所得细胞为心肌微血管内皮细胞。
　　2.经免疫荧光染色分析，阴性对照组没有荧光产生，而加有一抗为ER单克隆抗体的细胞则被标记上了荧光。荧光显微镜观察表明心肌微血管内皮细胞内存在雌激素受体。
　　3.与对照组相比，17β-E2浓度在0．001～1μmol／L，作用24h后，可明显促进大鼠心肌微血管内皮细胞的增殖，有显著性差异（P<0.05），且在浓度为0.01μmol／L时效果最佳；17β-E2+他莫昔芬处理组，无显著性差异（P＞0.05），对CMEC的增殖无影响。
　　4.细胞划痕法检测17β-E2对细胞迁移能力的影响。与对照组相比，细胞划痕后，17β-E2（0.01）μmol／L干预12小时，划痕区相对距离明显减小，差异有显著性意义(P<0.05)，细胞迁移率为53％；17β-E2+他莫昔芬干预12小时，划痕区相对距离无明显差异（P＞0.05）。
　　5.Millicell小室测定法检测17β-E2对细胞侵入能力的影响，17β-E2能很大程度的诱导CMEC由微孔滤膜上层侵入到下层，且与对照组相比有显著性差异（P<0.05）；而17β-E2拮抗剂他莫昔芬可以阻断此作用。
　　6.与对照组比较，17β-E2组形成管样结构的数目明显增多，小管间距明显减小，并交织成网状，图像经量化分析后发现：管状分支点的平均数目对照组为12个/视野，17β-E2组为23个/视野，与对照组比较P<0.01，17β-E2+他莫昔芬组为12个/视野，与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。
　　7.17β-E2浓度在0.01μmol/L时，可明显促进大鼠心肌微血管内皮细胞VEGF的分泌，且与对照组比有显著性差异（P<0.01）。对照组和17β-E2+他莫昔芬处理组培养的CMEC上清液中VEGF浓度极低，且两组间比较无显著性差异（P>0.05）。
　　结论
　　1.通过取材部位、分离方法及细胞鉴定，本实验所得细胞为心肌微血管内皮细胞。
　　2.心肌微血管内皮细胞内存在雌激素受体。
　　3.17β-E2可明显促进CMEC的增殖，在其浓度为0.01μmol/L时产生最大增殖效应，17β-E2受体拮抗剂他莫昔芬可阻断此效应。
　　4.17β-E2可促进CMEC迁移、侵入及分化成管样结构，17β-E2受体拮抗剂他莫昔芬可阻断此效应。
　　5.与对照组及17β-E2+他莫昔芬组相比，17β-E2可明显促进大鼠心脏微血管内皮细胞VEGF的分泌（P<0.01），他莫昔芬可阻断此效应。
　　6.本实验结果证实，适当浓度的17β-E2有促进大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生的作用，这为17β-E2应用于冠心病的血管新生治疗提供了实验基础及理论依据。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1.雌激素的受体及其在心血管系统的分布

2. 雌激素对心血管系统保护作用的表现

正 文

实验一 大鼠 CMEC 的培养和鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 CMECs 雌激素受体表达的测定

1 材料

方法

结果

讨论

实验三 17β-雌二醇对大鼠心肌微血管内皮细胞的促血管新生作用及其机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢