PKR活性对宫颈癌Hela细胞中p53作用及相关机制的初步研究

摘要

研究背景：
　　宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，其病死率居女性癌症病死率的第二位，是严重威胁妇女健康的主要疾病之一。研究证实，高危型人乳头瘤病毒(hulnan papillomavirus，HPV)是导致宫颈癌的主要原因。几乎所有的宫颈癌组织含有HPV，其中，HPV-16、HPV-18是最常见的型别。目前，宫颈癌的治疗采用以手术和放射治疗为主，同时辅以化疗的综合治疗。因此，不可避免的会给患者，尤其是尚未生育的育龄妇女带来巨大痛苦。如何更加安全、有效地早期预防宫颈癌发生；在常规手术的基础上，增加宫颈癌放、化疗敏感性，成为当前研究的热点与难点。因此探讨宫颈癌的发生机制、寻找新的研究靶点、为肿瘤基因治疗提供新思路无疑具有十分重要的意义。
　　宫颈癌的发生机制非常复杂，往往不是单一因素所导致的，普遍认为是多种致病因素共同作用的结果。许多研究结果表明，宫颈癌的发生与肿瘤抑制基因有密切关系。
　　p53是一种肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子。在正常细胞中，控制着细胞分裂周期、凋亡、DNA损伤修复。p53基因的突变通常会导致肿瘤细胞中p53蛋白的过度表达，已在许多肿瘤患者血清中发现了抗p53抗体。文献报道，宫颈癌中p53蛋白阳性率明显高于正常宫颈组织，p53蛋白的阳性表达率与宫颈癌的组织分化程度密切相关，低分化者的p53蛋白表达高于高分化者，p53蛋白阳性者术后生存率低、生存期短。
　　目前已发现一些小分子和肽能够恢复p53突变体的功能，增强肿瘤细胞的凋亡敏感性。许多因子和蛋白都能影响p53的活性，发挥其促凋亡的功能。因此，需要探明更多的p53相关分子，及其在调节p53肿瘤抑制功能中的作用。p53的调节非常复杂，主要发生在翻译后水平。而翻译又有起始、延长、终止三个阶段。大多数p53的调节主要发生在翻译起始阶段。这个过程中最重要的就是翻译起始因子eIF-2在α亚基的磷酸化。而eIF-2α的磷酸化是由eIF-2α激酶家族调控的。PKR就是eIF-2α激酶家族中的一员。病毒感染复制产生的dsRNA能够激活PKR，进而磷酸化其底物eIF-2α，磷酸化的eIF-2α抑制蛋白质合成，包括病毒蛋白的合成，诱导被感染细胞凋亡，在控制病毒复制中起着非常重要的作用。
　　研究目的：
　　1.从细胞水平明确宫颈癌细胞系Hela中，活化的PKR对p53的影响；
　　2.初步探讨Hela细胞中，激活PKR影响p53的机制。
　　研究方法：
　　1.激活PKR后，利用western blot检测Hela细胞中p53及PKR下游主要作用产物的水平。
　　2.利用免疫荧光染色法检测Hela细胞中p53的表达情况，明确在Hela细胞中PKR与p53的关系。
　　3.使用RNA干扰的手段对Hela细胞中PKR基因实施特异性抑制，并通过western blot方法检测其抑制效率。
　　4.利用salubrinal抑制eIF-2α去磷酸化后，利用western blot和免疫荧光染色检测Hela细胞中PKR影响p53与eIF-2α磷酸化的关系。
　　研究结果：
　　1.dsRNA类似物polyIC能够促p53降解、胞浆移位。同时使eIF-2α磷酸化增多；
　　2.Hela细胞中p53主要位于胞核中，胞浆中也有。
　　3.MG132预处理细胞可明显抑制p53降解及向胞浆移位。
　　4.成功构建PKR的siRNA片段，并通过western-blotting证实了PKR的蛋白表达水平下降，综合说明构建的常规siRNA片段有明显抑制PKR蛋白表达的效果；
　　5.polyIC活化PKR，PKR使其作用底物eIF-2α磷酸化、p53降解；
　　6.salubrinal能够明显抑制eIF-2α去磷酸化。eIF-2α磷酸化状态增多，但是p53蛋白含量并没有降低，p53也没有向胞浆移位。
　　结论：
　　1.宫颈癌Hela细胞中，dsRNA激活PKR，促p53降解、核输出。当利用siRNA沉默PKR后，p53不降解，没有发生核输出。说明在宫颈癌Hela细胞中，PKR对p53的稳定性起着负调节作用。但是在DAN损伤时，PKR被激活，又能促p53稳定。因此，在宫颈癌Hela细胞中PKR调节p53的能力可能与HPV感染有关。
　　2.虽然eIF-2α磷酸化在调节基因水平表达，终止翻译起始阶段非常重要，但在Hela细胞中，活化PKR促p53降解却不需要eIF-2α磷酸化。这说明在宫颈癌Hela细胞中，dsRNA激活PKR是通过其他途径对p53起作用的。
　　3.宫颈癌中p53蛋白阳性率比正常宫颈组织高，p53蛋白的聚积抑制了已经癌变的细胞发生凋亡。因此，针对PKR能够促p53降解，降低宫颈癌中p53含量，同时PKR又能促细胞凋亡这个方面，将两者结合可能可以促进肿瘤细胞发生凋亡。

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前言

文 献 回 顾

一、 p53

二、PKR

三、p53 与 PKR

正文

实验一 Hela 细胞中 dsRNA 激活 PKR 对 p53 的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 siRNA 对 PKR 的抑制效果与 PKR 激活后 p53 变化的观察

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 dsRNA 激活 PKR 促 p53 降解与 eIF-2α磷酸化的关系

1 材料1.1 细胞株

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢