Ⅰ.NgR辅受体复合物在大鼠垂体后叶的表达及其与垂体细胞之间缝隙连接的关系;Ⅱ.大鼠呼吸节律产生中枢pre-Bötzinger complex参与呼吸可塑性调控的形态学研究

摘要

第一部分：成年哺乳动物中枢神经系统损伤后难以再生，是困扰神经科学界的百年难题和当代神经科学研究的一个前沿问题。近年来人们认识到少突胶质细胞的髓鞘蛋白是抑制再生的主要因素，其抑制轴突生长的机制已成为研究者关注的焦点。
　　NgR是少突胶质细胞来源的轴突生长抑制因子Nogo-A的受体。最近的研究发现，除了神经元，胶质细胞也表达NgR蛋白，但这种分布的意义尚不明确。我们前期的研究发现在垂体后叶，NgR蛋白定位于垂体细胞(pituicyte)之间的缝隙连接处。这一发现提示，星形胶质细胞表达的NgR可能具有调节缝隙连接活动的新功能。由于NgR缺乏胞内段，因此需要其辅受体LINGO-1/p75或LINGO-1/TROY的参与才能行使功能。为了进一步研究在缝隙连接处NgR是如何起作用的，我们首先从光镜水平观察了正常大鼠垂体后叶LINGO-1/p75/TROY与Cx43的共定位情况，并从亚细胞水平确定了LINGO-1/p75/TROY与缝隙连接的位置关系。通过实验结果我们发现：
　　1、在光镜水平，LINGO-1/p75/TROY与星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43在大鼠垂体后叶的双标记普遍存在；
　　2、通过免疫电镜实验，我们发现大鼠垂体后叶的LINGO-1/p75/TROY多分布于垂体细胞的胞浆中，并未发现表达在缝隙连接上；
　　3、由于前期研究中发现被认为是星形胶质细胞来源的垂体细胞仅部分为GFAP免疫阳性细胞，我们研究了另一种星形胶质细胞标记蛋白S100β在大鼠垂体后叶的表达，结果显示S100β阳性率均显著高于GFAP；免疫电镜双标记结果也证实S100β能标记两种亚型即实质型和纤维型的垂体细胞，而GFAP只标记其中的一种即实质型。
　　综上所述，我们的研究表明LINGO-1/p75/TROY表达于大鼠垂体后叶的垂体细胞上，光镜下与Cx43密切相关，电镜水平可定位于大鼠垂体后叶垂体细胞胞浆内，但是与缝隙连接并无密切相关。这为我们了解NgR在星型胶质细胞处行使功能的作用方式提供了新的思路。同时我们发现，S100β可能比GFAP更适合于做为大鼠垂体后叶垂体细胞的标记蛋白。
　　第二部分：呼吸可塑性是指在生理或病理条件下诱发的长时间的呼吸活动的改变。这一功能的失调可能影响正常气道通气状态，并有可能引发睡眠呼吸障碍，如睡眠呼吸剥夺(OSAS)和新生儿猝死综合症(SIDS)等。目前研究呼吸可塑性最常用的是长时程易化(long-termfacilitation,LTF)模型，它是由间断性缺氧引起的膈神经放电的持续增强，并且5-HT2A受体(5-HT2AR)在其中起重要作用。然而，呼吸可塑性相关的大量研究都集中在颈髓膈核处，而被认为是呼吸节律产生中枢的前包钦格复合体(pre-B?tzingercomplex,pre-B?tC)是否参与呼吸可塑性仍然知之甚少。我们通过建立低压氧仓慢性间断性缺氧(chronicintermittenthypoxia,CIH)大鼠模型，模拟了高原缺氧，成功诱导出高大的膈神经LTF。本实验应用这一LTF模型，用NK1R作为特异性标记物，试图观察正常和CIH大鼠pre-B?tC内5-HT/5-HT2AR系统及其下游信号途径，包括磷酸化的(phosphor,P)-PKCθ/P-PKC底物和P-CaMKII/P-CREB的表达变化。我们发现：相对于正常大鼠，5-HT和5-HT2AR在CIH组表达增高。特别值得关注的是，在正常大鼠，5-HT2AR大部分位于细胞膜内表面，而在CIH干预后沿细胞膜外表面分布，并且在细胞膜的内陷处也可见到5-HT2AR的分布，这种胞膜的内陷通常认为与受体的胞吞和胞吐过程相关。5-HT2AR的这种膜转位现象提示CIH可激活pre-B?tC内的5-HT/5-HT2AR系统。与之相一致的，Westernblot结果显示P-PKCθ/P-PKC底物和P-CaMKII/P-CREB也在CIH后表达增多。更为重要的是，P-PKCθ和P-CaMKII与突触后致密体的密切关系，提示pre-B?tC神经元可能通过突触后机制来接到其对呼吸可塑性的作用。
　　5-HT2AR是G蛋白偶联受体，其作用的发挥依赖于第二信使的激活。5-HT2AR通过其作用产物IP3和DAG分别激活CaMKII和PKC。本实验首先从形态学上证明了大鼠pre-B?tC存在5-HT→5-HT2AR→P-PKCθ和5-HT→5-HT2AR→CaMKII→CREB两条通路，并且在CIH干预后这两条通路被明显激活。这为深入探讨pre-B?tC参与呼吸可塑性调控的功能学研究奠定了细胞神经化学的形态学基础。

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第一部分：NgR 辅受体复合物在大鼠垂体后叶的表达及其与垂体细胞之间缝隙连接的关系

前言

文献回顾

1. NgR 辅受体复合物研究回顾

2. 缝隙连接研究进展

正文

实验一 垂体后叶垂体细胞标记物的选取

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

实验二 垂体后叶 NgR 辅受体复合物的表达及其与垂体细胞间缝隙连接的关系

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二部分：大鼠呼吸节律产生中枢 pre-B?tzinger complex 参与呼吸可塑性调控的细胞内信号途径

前言

文献回顾

1. 呼吸中枢的定位

2. 脑干呼吸节律产生中枢—pre-B?tzinger complex

3. 呼吸系统神经元突触可塑性的相关研究

4. 调节呼吸神经元 LTF 的通路的研究现状

5. 本实验室前期研究基础

正文

实验一 5-HT和 5-HT2AR在正常和慢性间断性缺氧大鼠pre-B?tC的表达

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

实验二 慢性间断性缺氧大鼠 pre-B?tC 高表达P-PKCθ 和 P-PKC 底物

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

实验三 慢性间断性缺氧干预上调了 pre-B?tC P-CaMKII 和 P-CREB 的表达

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢