用RNAi技术逆转人涎腺腺样囊性癌和粘液表皮样癌细胞耐药性的初步研究

摘要

腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma, ACC)占涎腺恶性肿瘤约27％,粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)占涎腺恶性肿瘤约30％,治疗方法以外科手术为主,晚期及有广泛侵袭转移的病例需要采用放射治疗或药物治疗,然而癌细胞的多药耐药性使药物治疗难以获得理想的效果。多药耐药(MDR,Multidrug resistance)是指由于长期使用一种药物而产生的对多种药物耐药的特性。目前研究最广泛的耐药机制是细胞将药物泵出的膜转运蛋白。p-糖蛋白(P-gp,p-glycoprotein)、多药耐药相关蛋白(MRP,Multidrug resistance-associated protein)是与耐药相关的两个主要蛋白。我们在前期的研究中建立了ACC和MC3的耐药细胞系ACC-2/BLM和MC3/5-FU,发现耐药细胞中编码MRP1蛋白的基因ABCC1基因(又称MRP1基因)在ACC-2/BLM高表达,本研究发现ABCC1在MC3/5-FU细胞中也高表达,用RNAi技术沉默ABCC1基因后,耐药细胞的耐药性被逆转,说明ABCC1可能在ACC和MC3的耐药中都发挥着重要作用,同时也说明用RNAi技术可以逆转腺样囊性癌和粘液表皮样癌细胞的耐药性。
　　研究内容:1.运用体外药物诱导和裸鼠体内移植瘤模型诱导相结合的方法,维持和提高ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性。2.应用Agilent人类全基因4*44K芯片检测ACC-2与ACC-2/BLM细胞以及MC3与MC3/5-FU细胞表达差异基因,对基因芯片检测获得的数据用National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID), NIH提供的DAVID Bioinformatics Resources6.7软件进行分析(网址http://david. abcc.ncifcrf.gov/)。对丰度记分(Enrichment Score,ES)大于1的基因进行差异表达基因的功能分类(“GO”分析)。3.用RT-PCR验证分析两组细胞部分共同差异表达的基因,确定ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞共同表达的耐药基因。4.用Lipofectamine2000将本课题组前期实验中设计构建的真核表达载体(包括含有针对ABCC1基因的4个不同shRNA片段)pGPU6/GFP/ Neo-ABCC1 shRNA转染ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞,通过RT-PCR分别检测转染72h后ABCC1基因沉默情况,选出效率最高的shRNA,挑出转染该片段的单克隆细胞,扩大培养,检测其mRNA和蛋白质的表达下降情况,并检测其耐药性的改变。
　　实验结果:1、维持和提高了ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性,两株细胞已在体外维持培养均超过1年,经过1年体外、体内的维持诱导,BLM对ACC-2细胞对BLM、5-FU、CDDP、CTX、VCR的耐药性分别提高了33.3％、29.7％、5.3％、14.7％、10.0％; MC3/5-FU细胞对5-FU、BLM、VCR、VBL和CDDP的耐药性分别提高了171.5％％、73.1％、41.2％、20.1％和634.0％
　　2、用包括45,015个基因的表达谱芯片检测,ACC-2/BLM和ACC-2相比较表达上调基因(Ratio2.5)514个;表达下调基因(Ratio0.4)466个;MC/5-FU与MC细胞相比较表达上调基因(Ratio2.5)198个;表达下调基因(Ratio0.4)384个。并对丰度记分(Enrichment Score,ES)大于1的基因进行差异表达基因的功能分类(“GO”分析)。耐药细胞中高表达的基因大致包括生长因子、细胞外基质等基因。耐药细胞中低表达的基因大致包括细胞对药物或内外、外界刺激反应、细胞凋亡等基因。
　　3、对7个基因的表达用RT-PCR方法进行了验证,结果与基因芯片检测趋势一致,但有差别。基因芯片检测结果按照“差异基因筛选标准为ratio＞2.0为上调基因,ratio＜0.5为下调基因”的原则,CA9和TGM2在两个耐药细胞系中高表达,AIF、CXCR4、P53在ACC-2/BLM细胞中低表达,在MC3/5-FU细胞中表达与MC3无差异。HIF1在两对耐药细胞和亲本细胞中表达无差异。ABCC1在ACC-2/BLM中高表达,在MC3/5-FU和MC3细胞中表达无差异。RT-PCR检测结果两个耐药细胞系共同高表达CA9、CXCR4、HIF1和ABCC1,共同低表达TGM2、AIF和P53。
　　4、运用本课题组前期实验中设计构建的真核表达载体(包括含有针对ABCC1基因的4个不同shRNA片段)pGPU6/GFP/Neo-ABCC1分别转染ACC-2/BLM细胞和MC3/5-FU细胞,对ACC-2/BLM细胞转染效率约为40-50％,对MC3/5-FU细胞细胞转染效率约为30％。RealTime-PCR结果显示,转染第4个shRNA片段的细胞,ABCC1 mRNA在72h时表达水平明显下降,挑出其单克隆进行细胞扩大培养,蛋白表达明显下降,克隆形成率明显下降。被转染的ACC-2/BLM细胞对BLM、5-FU、CDDP、CTX、VCR的耐药性逆转率(％)分别为92.55、63.48、50.42、11.38、81.13;裸鼠体内耐药性逆转率为43.8％。被转染的MC3/5-FU细胞对对CTX、VCR、BLM、CDDP、5-FU耐药性逆转率(％)分别为34.7、16.4、30.1、69.9、97.9;裸鼠体内耐药性逆转率为42％。
　　结论:1、体内外诱导法提高了ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的多药耐药性。2、ACC-2/BLM产生多药耐药性与众多基因相关。3、ABCC1基因可能是ACC-2/BLM细胞系产生多药耐药性的主要相关基因。4、用RNAi技术沉默ABCC1基因可以逆转ACC-2/BLM和MC3/5-FU细胞的耐药性,对不同药物的耐药性逆转率不同。

目录

缩略语表

中文摘要

Abstract

前言

文献回顾

第一部分 体内体外法结合维持和提高 ACC-2/BLM 以及MC3/5-FU 细胞的耐药性

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 基因表达谱芯片技术筛选涎腺腺性癌和粘液表皮样癌耐药性相关基因

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三部分 ACC-2/BLM细胞和MC3/5细胞共同表达的部分耐药相关基因的筛选和鉴定

1 材料和方法

2 结果

3. 讨论

第四部分 MRP-1sh RNA 真核表达载体分别传染 ACC-2/BLM和 MC3/5-FU细胞株后耐药性的改变

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢