低碱性磷酸酯酶症患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究

摘要

低碱性磷酸酯酶症（Hypophospatasia，HPP）是一类涉及骨骼及牙齿发育缺陷的遗传性疾病，是由于肝/骨/肾碱性磷酸酯酶基因（ALPL）突变导致编码的非组织特异性碱性磷酸酶（TNAP）蛋白活性降低造成的。该疾病的临床表型高度变化，轻者仅表现为牙根发育不良导致的乳牙过早脱落，严重情况下可出现严重骨骼异常及高钙血症引发围产期死亡。按照临床表现可分成围产期型（致死性和良性）、婴幼儿型、儿童型、成人型和牙齿型。发育相关间充质干细胞及其微环境是维持骨骼及牙齿正常发育和修复再生的重要基础，因此通过研究发育相关干细胞的生物学特性，探索HPP导致牙根发育不良的致病机理，对该疾病的治疗十分必要。牙周膜干细胞能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和组织损伤修复的作用，具有自我更新和多向分化的能力。本实验首先通过临床及实验室检查，结合患儿脱落乳牙的病理学检查及电镜分析，对1例乳牙早脱的患儿进行初步的临床和病理诊断，确定该患儿的临床表型及牙齿发育异常表现；进而分离培养乳牙牙周膜干细胞，并对其进行来源鉴定和生物学特性的分析；继而通过对患儿及正常儿童乳牙牙周膜干细胞进行生物学特性的比较，探讨低活性的TNAP对乳牙牙周膜干细胞分化的影响，为深入阐明低碱性磷酸酯酶症的致病机制提供一定实验依据和研究基础。本课题的研究内容及结果如下：
　　第一部分：HPP患儿的临床、实验室和病理学检查及分析
　　本课题研究对象为1例乳牙过早脱落的患儿，为明确诊断和临床分型，我们对患儿进行了详细的临床及实验室检查，并对患儿脱落的乳牙进行病理学和扫描电镜检查，观察和分析乳牙组织结构及发育情况。临床和实验室检查结果发现患儿主要表现为乳牙过早脱落，恒牙发育及萌出迟缓，牙周组织发育缺陷而骨骼发育无明显异常；多次实验室检查均发现血清碱性磷酸酶活性低于正常参考值，患儿尿磷酸乙醇胺的检测也为弱阳性；病理学检查和扫描电镜观察发现，患儿乳牙牙本质矿化程度低，牙本质小管较正常乳牙粗大；牙骨质层较薄且厚度不均匀，表面凹凸不平，部分牙根表面无牙骨质覆盖。根据患儿的临床、实验室、病理学检查结果，该患儿初步诊断为牙齿型低碱性磷酸酯酶症。
　　第二部分：正常人乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究
　　本实验首次从正常人乳牙牙周膜中分离培养出干细胞，并通过免疫细胞化学方法和流式细胞仪对其来源进行鉴定，进而从增殖能力和多向分化能力等方面对乳牙牙周膜干细胞的生物学特性进行研究。实验结果显示：分离培养获得的人乳牙牙周膜干细胞在形态上与恒牙牙周膜干细胞相似，均为长梭形成纤维细胞样；免疫细胞化学和流式细胞仪分子表型鉴定显示乳牙牙周膜干细胞阳性表达间充质来源的表面标志STRO-1,CD146,CD29和CD90，而造血系来源的标志物CD34为阴性；细胞周期，MTT和克隆形成率的检测结果显示，人乳牙牙周膜干细胞的增殖能力强于恒牙牙周膜干细胞；人乳牙牙周膜干细胞在体外诱导条件下可以向成骨，成脂方向分化；同时RT-PCR检测发现，矿化诱导后细胞成骨相关基因（ALP，OCN和ColI）的表达上调，而成脂诱导后细胞成脂相关基因（PPAR-γ和C/EBPα）的表达上调。以上结果说明乳牙牙周膜中确实存在间充质来源的干细胞，并且具有很强的增殖能力和多向分化的能力，尤其是具备比恒牙牙周膜干细胞更强的增殖能力，是一种理想的种子细胞。
　　第三部分：HPP患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究
　　本实验首先分离培养HPP患儿和健康儿童乳牙牙周膜干细胞，进而比较两者在增殖和分化能力方面的差异，探索低活性的TNAP对牙周膜干细胞生物学行为的影响。细胞周期，MTT和克隆形成实验结果发现，HPP患儿的乳牙牙周膜干细胞在增殖能力上明显较正常细胞弱。两组细胞矿化诱导后HPP患儿细胞形成的矿化结节数量明显少于正常组。ALP活性分析显示，各个时间观察点患儿乳牙牙周膜干细胞的ALP活性都明显低于同一时间点正常组细胞的ALP活性。Real-timePCR结果显示，HPP患儿细胞RUNX2基因表达低于正常组，而其它相关功能基因ALP，OCN和CP23基因表达量均为患儿组高于正常组。体内移植实验发现，正常乳牙牙周膜干细胞与牙本质片复合植入裸鼠体内可形成牙周膜纤维样的结构；而患者细胞仅形成环绕牙本质片的不规则纤维。以上结果说明HPP患儿乳牙牙周膜干细胞的增殖能力和成骨能力明显低于正常细胞，低活性的TNAP影响乳牙牙周膜干细胞的生理功能及分化。

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缩略语表

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文献回顾

一 低碱性磷酸酯酶症研究进展

二 牙周膜干细胞的研究进展

正 文

第一部分 HPP 患儿的临床、实验室和病理学检查及分析

1 材料与方法

2.结果

3 讨论

第二部分 正常人乳牙牙周膜干细胞的生物学行为的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 HPP 患儿乳牙牙周膜干细胞生物学行为的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小 结

参考文献

附 图

个人简历和研究成果

致谢