Cajal间质细胞在实验性乳鼠巨结肠模型不同肠段的分布变化研究

摘要

先天性巨结肠（Hirschsprung’sdisease，HD）是一种肠神经系统先天性异常疾病，其发病机制尚不十分明确[1]。目前多认为遗传及环境多种因素综合作用、共同调控的结果[2]。发病率为1/5000，以男性多见，男：女为4：1。近年来HD的发病率似有上升趋势[1,2,3]。主要病理改变为病变结肠段神经节细胞缺如，病变结肠持续性痉挛，狭窄，肠蠕动障碍，近端肠腔扩张，内容物潴留，形成巨结肠。新生儿表现为胎粪延迟排出、肠梗阻等症状，婴儿和成人表现为严重便秘、腹胀，常合并小肠结肠炎、低位肠梗阻，严重影响患儿生活质量甚至危及生命[2,4]。研究显示，HD患儿严重的结肠功能障碍与Cajal间质细胞(interstitialcellsofCajal，ICC)ICC的分布、数量及功能密切相关[4]。ICC广泛分布于消化道，是胃肠慢波活动起搏细胞及基本电节律的主要传播细胞[5]，并参与胃肠道神经信息的传递[3]。由于直接人体研究会受到一定限制，本研究以6～7日龄SD乳鼠为实验动物制备巨结肠模型，采用ICC的特异标志物c-kit多克隆抗体免疫荧光染色，对ICC在巨结肠模型狭窄段、扩张段和移行段的分布规律进行了较详细的观察，探讨ICC在HD发病中的作用，为研究HD肠运动功能障碍和治疗提供实验依据。为日后进一步深入研究HD及其相关并发症的病因病理生理机制、病程演变特征及治疗方面等奠定实验基础。
　　目的用化学方法选择性损毁6～7日龄SD乳鼠结肠神经节细胞，建立接近于人类HD的实验性乳鼠巨结肠模型；通过大体观察，组织病理学，NSE和S-100蛋白免疫组化鉴定模型；c-kit多克隆抗体免疫荧光检测实验性乳鼠巨结肠模型结肠狭窄段、扩张段、移行段和正常组中ICC分布、形态变化，探讨ICC在HD发病中的作用，为探索适应范围广、安全、有效、无创的治疗新方法奠定实验基础。
　　方法
　　1．9窝(每窝10只乳鼠)6～7日龄SD乳鼠随机分为3组，实验组3窝用0．1％苯扎氯铵(Benzalkoniumchloride，BAC)溶液处理降结肠15min，对照组用生理盐水代替，正常组不做任何处理。
　　2．分别于术后第1、3、5、6、7周每组随机取2只乳鼠处死，通过大体观察处理段结肠及近端结肠形态变化，组织学病理学、NSE和S-100蛋白免疫组织化学染色观察结肠神经节细胞的消除情况。
　　3．c-kit多克隆抗体免疫荧光染色检测ICC在乳鼠巨结肠模型结肠狭窄段、扩张段、移行段和对照组的分布、形态变化。
　　结果
　　1．实验组和对照组术后1～3周大体观察无明显变化，术后4～6周实验组部分大鼠出现腹胀，排便减少，粪便颗粒变小，处死后大体解剖可见BAC处理段狭窄。术后7周实验组大鼠均出现不同程度的排便减少，腹胀，精神萎靡，消瘦，粪便颗粒比对照组和正常组干燥且明显变小，处死后大体解剖发现，BAC处理段肠管狭窄痉挛，无蠕动，病变近端肠管扩张，肠腔内容物潴留。对照组及正常组大鼠肠管无此变化。
　　2．实验组术后1、3、5、6周组织病理学可见肌间及粘膜下神经节细胞逐渐减少，术后7周肌间及粘膜下神经节细胞完全消失，肠壁其他结构完整，未发现瘢痕的形成及炎症细胞的浸润。对照组和正常组可见正常的肌间和粘膜下神经节细胞。
　　3．实验组S-100蛋白和NSE表达在术后1、3、5、6周位于肌间及粘膜下神经节细胞逐渐减少，术后7周肌间及粘膜下S-100蛋白和NSE表达的神经节细胞完全消失，对照组及正常组无明显变化。术后7周通过大体观察、实验组HE染色、免疫组织化学染色可见肌间和粘膜下神经节细胞消失，表明巨结肠模型建立成功。
　　4．c-kit多克隆抗体免疫荧光检测ICC在实验性乳鼠巨结肠不同肠段的分布。对照组结肠组织ICC主要分布于粘膜下神经丛和肌间神经丛，ICC呈连续性分布，相互连接形成网络状结构。狭窄段结肠组织ICC的分布显著减少或消失，较移行段、扩张段和对照组均有显著性差异(P<0．01)，ICC的网络状结构完全破坏，残存ICC形态异常，移行段结肠组织内ICC的分布较对照组和扩张段组均减少(P<0．05)，其形态部分接近正常，但ICC缺乏连续性分布，未能形成正常的网络状结构。扩张段与对照组结肠组织内ICC分布，无显著性差异(P>0．05)。
　　结论
　　1．6～7日龄乳鼠用0．1％BAC可成功建立乳鼠巨结肠模型，该模型与HD具有相似的病理特征；
　　2．结肠神经节细胞的数量及功能与HD的发生发展有密切关系；
　　3．NSE、S-100蛋白可作为诊断和鉴别HD的特异性指标；
　　4．观察ICC在乳鼠巨结肠模型狭窄段、移行段和扩张段肠管分布与形态的差别，发现人工制备的乳鼠巨结肠模型狭窄段结肠组织ICC的分布较正常组大鼠明显减少，ICC形态变钝、突起减少或消失，网络状结构受到破坏，更直观的体现了ICC与HD的发生发展密切相关。

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正 文

实验一 实验性巨结肠乳鼠模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Cajal 间质细胞在乳鼠巨结肠模型不同肠段的分布变化研究

1 资料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

附 录

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致谢