Egr-1介导胶质瘤细胞内Survivin促进血管形成实验研究

摘要

恶性脑胶质细胞瘤是颅内常见的原发肿瘤，外科手术结合术后放疗、化疗，患者的中位生存时间一般少于18个月。因此迫切需要对其发病机理及治疗环节进行较为系统的研究，寻找新型的治疗方式，突破目前治疗中遇到的瓶颈，以提高恶性胶质细胞瘤患者的生存时间和生活质量。
　　血管形成是一个复杂的生理进程，是指诱导已经存在的血管，形成新生血管的过程。正常条件下，血管形成被严格调控并在刺激因素和抑制因素之间维持一个动态平衡。当刺激因素占据优势地位（血管形成启动），就会导致一系列级联反应（基底膜降解，内皮细胞迁移、增殖及管腔形成）的发生。胶质细胞瘤属于血管增殖极为活跃的实体瘤，血管形成在胶质细胞瘤的进展中发挥重要作用。
　　Survivin是IAP家族最小的成员，具有抗细胞凋亡及促进有丝分裂的功能。并且Survivin在肿瘤组织中高表达、于正常的终末分化组织中为低表达的特点，使之有望成为肿瘤治疗的新靶点。我们在前期的研究中发现胶质瘤细胞中的Survivin与胶质细胞瘤的病理级别呈正相关，和胶质细胞瘤中的微血管密度亦呈正相关，并且干涉胶质瘤细胞中的Survivin，不仅可以抑制胶质瘤细胞的增殖，降低其在裸鼠中的成瘤性，并且可以降低移植瘤组织中的微血管密度，这提示我们在胶质瘤细胞中的Survivin有可能参与瘤组织中血管形成的调节。但是据此尚不能确定胶质瘤细胞中的Survivin对瘤组织内血管形成的作用。根据以往文献报道，野生型Survivin可以上调胰岛素细胞中Egr-1的表达。Egr-1是一个重要的转录因子，很多促血管形成因子的启动子区都有Egr-1的结合位点。据此我们推测胶质瘤细胞中的Survivin可以通过Egr-1来调控胶质瘤细胞中促血管形成因子的表达及分泌，进而促进胶质细胞瘤中的血管形成。
　　目的：探索胶质瘤细胞中的Survivin是否可以影响瘤组织中的血管形成，并探讨其发挥作用的机制。
　　方法：采用脂质体法，将Survivin的真核表达载体pcDNA3.1-Survivin，Egr-1的真核表达载体pcDNA3.1-Egr-1，同时携带Survivin和Egr-1shRNA表达框的真核表达载体pcDNA3.1-Survivin-EgrshRNA及空载体pcDNA3.1分别转染SHG44细胞，将Survivin的干涉载体pRNAT-SurvivinshRNA、Egr-1的干涉载体pRNAT-Egr-1shRNA及无关插入序列载体Prnat-NSsi和空载体pRNAT-U6.1/Neo分别转染U251细胞，通过G418筛选出稳定转染不同克隆的细胞系。分别采用MTT法、Transwell小室、血管管状形成实验，检测亲代SHG44细胞、转染Survivin的SHG44细胞、亲代U251细胞、抑制Survivin的U251细胞对HUVECs增殖、迁移及形成血管功能的影响。采用qPCR检测各组细胞中三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的mRNA水平，采用Westernblot检测各组细胞中三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的蛋白表达水平，采用ELISA方法检测三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF在相应细胞培养液上清中的水平。将各组细胞接种于裸鼠背部，构建荷瘤裸鼠模型，观察各组瘤细胞的生长情况，并测定移植瘤体积，检测瘤组织内MVD，Ki67，Survivin，Egr-1及三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的表达情况。
　　结果：将HUVECs和胶质瘤细胞共培养，强制表达Survivin的SHG44细胞对HUVECs增殖、迁移及血管形成的刺激作用明显强于亲代SHG44细胞，亲代U251细胞对HUVECs增殖、迁移及血管形成的刺激作用明显强于抑制Survivin表达的U251细胞。Westernblot检测结果发现，转染Survivin的SHG44细胞中可以检测到bFGF表达，未检测出VEGF和PDGF表达，转染空载体的SHG44细胞和亲代SHG44细胞中始终未检测出VEGF、bFGF和PDGF表达；转染Egr-1的SHG44细胞中可以检测到VEGF和bFGF表达，未检测出PDGF表达，转染空载体的SHG44细胞和亲代SHG44细胞中始终未检测出VEGF、bFGF和PDGF表达。qPCR检测的VEGF、bFGF和PDGF转录水平，ELISA检测相应细胞培养液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量变化与Westernblot检测的结果一致。Westernblot检测结果发现，干涉Survivin表达的U251细胞中VEGF、bFGF表达下调，PDGF表达无变化，转染空载体、无关序列的U251细胞和亲代U251细胞中VEGF、bFGF和PDGF表达无变化；干涉Egr-1的U251细胞中VEGF和bFGF表达下调，PDGF表达无变化，转染空载体、无关序列的U251细胞和亲代U251细胞中VEGF、bFGF和PDGF表达无变化。qPCR检测的VEGF、bFGF和PDGF转录水平，ELISA检测相应细胞培养液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量变化与Westernblot检测的结果一致。Westernblot、qPCR和ELISA检测的结果显示，与强制表达Survivin的SHG44细胞相比，转染既表达Survivin同时干涉Egr-1表达的SHG44细胞中bFGF明显降低。将不同的细胞接种裸鼠后，转染Survivin或者转染Egr-1的SHG44细胞生长速度明显快于亲代SHG44细胞。干涉Survivin的U251细胞与亲代细胞相比，生长速度明显减慢，干涉Egr-1的U251细胞与亲代细胞相比的生长速度相比没有差异。转染既表达Survivin同时干涉Egr-1的SHG44细胞与强制表达Survivin的SHG44细胞相比，其生长速度明显减慢。Ki67的免疫组化检测结果显示，与亲代SHG44细胞相比，转染Survivin或转染Egr-1的SHG44细胞中的Ki67阳性细胞增多，与亲代U251细胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251细胞中Ki67阳性细胞减少，转染既表达Survivin同时干涉Egr-1的SHG44细胞与仅转染Survivin的SHG44相比Ki67阳性细胞减少。MVD结果表明，与亲代SHG44细胞相比，转染Survivin或转染Egr-1的SHG44细胞中的MVD增多，与亲代U251细胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251细胞中MVD减少，转染既表达Survivin同时干涉Egr-1的SHG44细胞与仅转染Survivin的SHG44细胞相比MVD减少。半定量免疫组化评分结果证明，与亲代SHG44细胞相比，转染Survivin的SHG44细胞中VEGF、bFGF、PDGF表达上调，转染Egr-1的SHG44细胞中VEGF、bFGF、PDGF表达上调；转染既表达Survivin同时干涉Egr-1的SHG44细胞与仅转染Survivin的SHG44相比，VEGF、bFGF、PDGF表达下调；与亲代U251细胞相比，干涉Survivin的U251细胞中VEGF、bFGF和PDGF表达下调；干涉Egr-1的U251细胞中VEGF、bFGF和PDGF表达下调。
　　结论：胶质瘤细胞中的Survivin在体外可以促进内皮细胞的增殖、迁移及管状形成等功能，在体内可以提高瘤组织内MVD。这些作用的发挥是通过胶质瘤细胞内的Survivin上调促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的转录、表达及分泌实现的。Survivin发挥促进这些因子的表达及分泌的功能时，需要转录因子Egr-1的介导。我们的实验首次证明了胶质瘤细胞中的Survivin，在转录因子Egr-1的介导下，可以促进瘤细胞中VEGF、bFGF和PDGF等因子的表达及分泌，进而促进胶质细胞瘤中的血管形成，这为抗Survivin的靶向治疗提供了理论基础。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 血管形成概述

2. 血管形成对胶质细胞瘤的作用

3.胶质细胞瘤中血管的结构和功能

4. Survivin 功能概述

5. 转录因子 Egr-1 的功能概述

正文

实验一 Egr-1 RNA 干扰载体及同时携带 Survivin 和Egr-1 shRNA 表达框的真核表达载体的构建、鉴定和细胞转染

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 胶质瘤细胞中的 Survivin 对内皮细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 胶质瘤细胞中的 Survivin 对促血管形成因子表达及分泌的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 胶质瘤细胞中的 Egr-1 对 Survivin 诱导的促血管形成因子表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 Survivin 和 Egr-1 对裸鼠体内促血管形成因子表达及血管形成的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

附录

致谢