清胃理肠胶囊对实验性溃疡性结肠炎大鼠T淋巴细胞亚群的影响

摘要

研究背景:
　　溃疡性结肠炎（UC）是一种局限在直肠、结肠粘膜及粘膜下层的慢性、非特异性、炎症性肠道疾病，以粘膜慢性炎症和溃疡形成为主要病理特点，主要临床表现有腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重等。该病以易于复发、缠绵难愈，长期消耗患者体质，降低其生活质量，而受到医务工作者的广泛关注，被公认为医学界的疑难病之一。在现代医学研究中UC的病因和发病机制尚未明确。
　　西医治疗UC以内科用药为主，传统药物有:
　　①类固醇类激素，代表性药物有氢化可的松、泼尼松；
　　②氨基水杨酸类抗炎药物，常用药如柳氮磺胺吡啶（SASP）。对于激素及抗炎药物无效的顽固病例或严重病例，会考虑应用；
　　③免疫抑制剂，主要有硫唑嘌呤（AZA）、羟基嘌呤（6MP）、环孢素（CYA）和甲氨蝶呤（MTX）。这些药物的作用重点在于缓解UC的急性发作，而对于慢性持续期的治疗及其反复发作、迁延难愈的特性则收效甚微。并且这三类药物都存在不同程度不同方面的不良反应。近年来又出现了从UC的免疫发病机制出发，针对炎症发生过程的重要步骤进行抗细胞治疗的生物学疗法，较成熟的有抗TNF单克隆抗体，但还没有明确、统一的疗效报道。
　　溃疡性结肠炎根据其临床表现，相当于中医理论中的“痢疾”，初则为实证，治疗不当或不及时，迁延反复，久则成正虚邪恋，虚实夹杂之虚性痢疾。中医认为痢疾的病因是外感时邪或内伤饮食：湿热或疫毒侵及肠胃，阻滞气血，相互搏结，腐化血肉而成痢；饮食不洁或不节，滞碍肠胃气机，酿湿生热，煎灼气血而成痢。在辨证论治时，按病因病机及临床表现将痢疾划分为湿热痢、疫毒痢、寒湿痢以及阴虚痢、虚寒痢和休息痢。各个证型因其病机不同而治法方药各异，湿热痢需清热解毒，行气活血，方以芍药汤为主；疫毒痢需清热凉血解毒，方以芍药汤为主；寒湿痢需温化寒湿，方以胃苓汤为主；阴虚痢需养阴清肠，方以驻车丸为主；虚寒痢需温补脾肾，涩肠固脱，方以桃花汤或真人养脏汤为主；休息痢需温中清肠，调气化滞，方以连理汤为主。后人对于痢疾治疗的经验总结是：热痢清之，寒痢温之，初痢实则通之，久痢虚则补之。寒热交错者，清温并用，虚实夹杂者，通涩兼施。
　　清胃理肠胶囊方组为枳实、厚朴、陈皮、半夏、大腹皮、莱菔子、栀子、延胡索、生甘草，秉承初痢实则通之的原则，主要针对湿热痢初起多实证而设。枳实、厚朴消积通滞，陈皮、半夏燥湿健胃，大腹皮、莱菔子行气除胀，栀子清热，延胡索调气行血止痛，生甘草调和诸药，共同达成清热利湿，行气活血，治疗湿热痢初起实证的效果。该药至今已应用于临床8年，对于相应证型的痢疾即溃疡性结肠炎有肯定的疗效。但还未通过实验室研究探讨过其起效机制，因此我在硕士就读期间，以研究清胃理肠胶囊的起效机制，使其能扬长避短，发挥最大的临床效用为宗旨，开展动物实验研究。
　　研究目的:
　　1、观察溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜的病理变化，以及清胃理肠胶囊对病变粘膜的修复作用。
　　2、研究T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+和溃疡性结肠炎发生的关系，以及清胃理肠胶囊对CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影响。
　　实验方法:
　　1、UC动物模型制造及分组：普通级SD大鼠62只，体重180g-220g。随机分为正常组12只和造模组50只。造模组大鼠颈背部剃毛，每天以20g/L的2,4-二硝基氯苯丙酮液滴背1次,每次每鼠0.3ml,连续14d,第15天用直径2mm硅胶管经肛门插入结肠8cm处,注入0.04mmol/L的2,4-二硝基氯苯乙醇液0.25ml,第16天同部位注入80ml/L醋酸溶液2ml,准确计时15s后用0.85％氯化钠5ml冲洗。造模结束次日，观察大鼠一般状况及粪便形态。并随机抽取正常组及造模组各2只大鼠处死，分离肛门上7～9cm处的结肠粘膜，肉眼观察比较其形态区别，并取部分结肠10％甲醛固定，做病理切片检查，判断造模是否成功。余造模组48只大鼠随机分为模型对照组、清胃理肠胶囊组、西药柳氮磺吡啶(SASP)组，每组16只。
　　2、给药方式：造模结束次日灌胃给药。清胃理肠胶囊弃胶囊壳，用蒸馏水将药粉配置成100mg/ml的混悬液。柳氮磺胺吡啶片(SASP)粉碎，用蒸馏水配置成50mg/ml的混悬液,根据人和动物用药剂量换算公式，即大鼠用药剂量=6.25×人的用药剂量。大鼠称重，取约值，清胃理肠胶囊组按3ml/只给药，SASP组按2ml/只给药。正常组和模型对照组给予生理盐水。每日一次灌胃给药，共持续20天。
　　3、观察指标：
　　①观察造模过程中及给药前后各组大鼠的一般情况。
　　②T淋巴细胞亚群检测：给药结束次日，2％戊巴比妥钠(3ml/Kg)麻醉大鼠，心脏取血100ul置入肝素钠真空抗凝采血管，加CD4、CD8单克隆抗体各20ul；混匀避光孵育30分钟，加溶血素0.5ml混匀，10分钟后1500r/min，离心5min，去上清，加pbs500ul上机检测。
　　③病理检查：取血后，剖腹取肛门以上6-9cm处肠段，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水洗净；粘膜向上平铺，观察病理改变。然后剪取部分结肠，10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察病理变化。
　　实验结果:
　　1、一般情况：造模后3天内大鼠精神萎靡，迅速消瘦，皮毛稀疏，出现脓血便。个别出现腹部鼓胀，该类大鼠都在2-3天内死亡。模型对照组死亡3只，清胃理肠胶囊组死亡1只，SASP组死亡2只。
　　2、病理改变：
　　①大体病理改变：正常大鼠结肠粘膜完整，薄而光滑，有一定透明度。造模后大鼠结肠粘膜普遍水肿、糜烂、溃疡、附着伪膜，并覆盖有连结成片的脓苔。
　　②组织病理改变：正常组粘膜上皮结构完整，固有层腺体排列整齐密集。造模后粘膜上皮细胞广泛脱落，血管壁增厚，组织水肿，大量炎细胞浸润，溃疡融合成片，隐窝消失。经治疗，清胃理肠胶囊组大鼠结肠接近正常，上皮结构完整，充血消失，有少量炎细胞浸润。SASP组仍有轻度水肿。
　　3、T淋巴细胞亚群：模型组与正常组比较CD4+、CD8+下降明显，CD4+/CD8+升高，差异具有统计意义（P<0.05）；清胃理肠胶囊组和SASP组经治疗后，与模型组比较，均显示CD4+、CD8+水平升高，CD4+/CD8+降低，差异有统计意义（P<0.05）；清胃理肠胶囊组指标接近正常对照组，两组之间无显著差异（P>0.05），其作用优于SASP组（P<0.05）。
　　结论:
　　1、清胃理肠胶囊对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜有明显修复作用。
　　2、清胃理肠胶囊可提升外周血CD4+、CD8+百分率，降低CD4+/CD8+水平，具有免疫调节作用。
　　本研究以动物实验形式探讨了清胃理肠胶囊对溃疡性结肠炎的作用机制，证实该药对UC大鼠的病变结肠有明显修复作用，并证明调节免疫机制是清胃理肠胶囊治疗溃疡性结肠炎的起效机制之一。本实验的研究方式、思路及结果，为清胃理肠胶囊治疗溃疡性结肠炎机制的后续研究提供了可参考模式和一定基础。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、现代医学对溃疡性结肠炎的认识

二、中国传统医学对溃疡性结肠炎的认识

三、关于清胃理肠胶囊

四、溃疡性结肠炎的实验室研究

正文

实验一

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

致谢