人精氨酸酶与人的血清蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性测定

摘要

人精氨酸酶（Arginase,ARG）与人血清蛋白(humanalbumin,HSA)的融合基因Hsa-Arg在毕赤酵母高效分泌表达，建立相应纯化工艺路线，并初步研究人精氨酸酶对黑色素瘤、喉癌和肝癌等肿瘤细胞的抑制效果，探讨人精氨酸酶作为抗癌药在生物制药领域的应用前景。
　　方法：以pET-30a(+)为克隆载体，将人血清蛋白基因Hsa与人精氨酸酶基因Arg以HindIII酶切位点进行基因融合，并且在两基因之间添加了由Gly与Ser组成的十个氨基酸的连接肽。再将融合基因以正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株后进行摇瓶水平的发酵。采用MTT法，测定人精氨酸酶对肿瘤细胞生长的抑制效果。
　　结果：人血清蛋白基因Hsa与人精氨酸酶基因的融合基因成功地构建到了酵母表达载体pPIC-Hsa-Arg，转化毕赤酵母GS115后筛选到高水平分泌表达目的蛋白Arg的菌株，目标蛋白可以分泌到培养基中，表达蛋白在上清中占90％以上。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化，即可获得纯度达到92％的活性产物。活性测定表明，纯化的Arg比活性为310IU/mg。肿瘤抑制实验发现，所有被测细胞的活力随着重组长效人精氨酸酶浓度的增加而降低。
　　结论：实验结果说明，人精氨酸酶与人血清蛋白的融合蛋白成功在毕赤酵母中得到了高效表达，并建立了目标物质的分离纯化工艺。人精氨酸酶对体外培养的黑色素瘤、喉癌和肝癌细胞具有抑制作用。

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实验一 人精氨酸酶与人血清白蛋白融合基因的毕赤酵母表达

实验二 人精氨酸酶融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的研究

小结

参考文献

附录

个人简历及研究成果

致谢