模拟失重条件下microRNA-494抑制成骨细胞分化作用机制的研究

摘要

空间长期重力环境的改变会引起机体多个系统的变化，包括骨质疏松、肌肉萎缩、免疫系统功能不全、心血管系统适应性减弱等。通过物理训练和营养补充等措施的实施可以缓解肌肉萎缩、提高心血管系统的适应性，然而，目前尚没有办法对抗微重力引起的宇航员骨质流失，这是威胁长期进行太空工作宇航员身体健康的最主要因素之一。微重力导致骨质流失速度大约为每月减少2％的骨矿物质密度，相当于绝经后妇女一年流失的骨量。研究表明，重力和机械负荷是保持骨骼完整性的重要因素，然而微重力环境引起骨质丢失的机制尚不完全清楚。已有的研究显示，失重引起的骨量减少是因为骨形成与重吸收之间的平衡被破坏，骨质形成减少，而重吸收保持正常或增加，最终导致了骨量丢失。由于成骨细胞分化是骨骼形成和维持骨量的关键步骤，所以目前被普遍接受的观点认为微重力导致的骨丢失的主要原因是成骨的细胞分化障碍，但是导致成骨细胞分化障碍的分子机制并不完全清楚。
　　miRNA是一类长度约18-25nt的小分子RNA，存在于包括哺乳动物在内的多种有机生命内。miRNA通过完全或不完全互补的方式结合于靶基因的mRNA的3’UTR，负向调控基因表达。大约超过30％的基因表达都受到miRNA的调控，表明miRNA调控基因表达这一现象是普遍存在的。miRNA在细胞增殖、分化、死亡等过程中发挥着至关重要的作用。许多研究认为，miRNA参与了对成骨细胞成骨过程的表达调控，是成骨细胞分化的重要的调节分子。
　　本研究中我们以BMP-2诱导小鼠间充质多能前体细胞C2C12成骨分化为研究对象，探讨模拟失重状态下，成骨细胞分化过程中miRNA表达谱的改变，进而研究miRNA在失重性骨丢失中的作用及其分子机制。本研究的主要发现和结果如下：
　　1.微重力抑制成骨细胞分化和成熟。我们首先在细胞水平上检测微重力对成骨细胞分化的影响。我们将C2C12细胞置于回转器培养，同时加入300ng/mlBMP-2诱导分化，对照组不加BMP-2刺激。72小时后，Real-timePCR检测成骨细胞特异基因碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）,骨钙素（osteocalcin，OC）,骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和Runx2，结果显示，在模拟失重环境下，成骨细胞分化受到显著抑制。成骨细胞分化过程有多条通路参与，我们检测了微重力对部分通路相关分子表达的影响。我们按上述方法处理C2C12细胞，72小时后收集细胞裂解液，Westernblot结果显示，微重力引起BMPR2、FGFR2、Runx2的蛋白表达降低。尾部悬吊能够消除大鼠后肢机械负荷，是研究模拟失重的良好动物模型。本研究中我们采用核素骨扫描检测了悬吊大鼠骨质形成。我们发现，与对照组大鼠相比悬吊大鼠骨和关节中99mTc-MDP的聚集明显减少，而且差异随悬吊时间延长而增大。该结果说明，微重力引起骨代谢减弱，骨生成减少。
　　2.微重力环境可以引起成骨细胞miRNA表达谱的改变。我们将C2C12细胞置于回转器中模拟失重培养，模拟失重培养细胞与对照细胞均加入BMP-2诱导其向成骨方向分化。72小时后，收集细胞提取总RNA并进行miRNA芯片检测。miRNA芯片筛选结果发现了７个显著差异表达的miRNA，其中表达上调的miRNA有2个，表达下调的miRNA有5个。Real-timePCR验证结果与芯片结果基本一致，其中mmu-miR-494模拟失重后表达水平明显升高，mmu-miR-18*,mmu-miR-122a,mmu-miR-301,andmmu-miR-340表达水平则显著降低，但mmu-miR-143的表达与对照组相比无显著差别。生物信息学方法预测表达上调的miR-494的靶基因参与成骨细胞分化，因此我们将关注的焦点放在对miR-494的研究上。给予BMP-2处理的C2C12细胞在模拟失重0、2、4、8、12、24、48和72小时后分别收集细胞检测miR-494表达水平的变化。我们发现，在模拟失重2小时，miR-494表达开始上升，并且随着失重时间的延长，miR-494表达持续升高。此外，我们分离了悬吊大鼠股骨近侧干垢端成骨细胞，检测其中miR-494表达水平，发现悬吊2周和４周的大鼠其成骨细胞内miR-494表达均明显上调，并随悬吊时间的延长而持续升高。该实验表明微重力环境能引起成骨细胞miRNA表达谱的改变，其中mmu-miR-494的升高十分显著，且其表达水平与模拟失重的时间正相关。
　　3.miR-494抑制成骨细胞分化。为了验证miR-494对骨形成的作用，我们首先检测miR-494对细胞增殖和细胞周期的影响。我们将miR-494mimics及其相应阴性对照（N.C.）转染C2C12细胞和MC3T3-E1细胞，MTT实验和流式细胞术分析结果表明，miR-494对细胞增殖和周期无明显影响。进一步的研究显示，在BMP-2存在时，miR-494能明显抑细胞ALP活性，但未给予BMP-2刺激时，这种抑制效果不显著，表明miR-494可能参与了对C2C12细胞成骨分化的抑制。随后，我们用Reai-timePCR、ELISA和WesternBlot分别在mRNA水平和蛋白水平检测了miR-494对成骨细胞特异基因ALP、OC、OPG、Runx2表达的影响。与ALP染色和活性测定结果一致，转染miR-494后细胞中ALPmRNA表达降低，而且无论是否存在BMP-2，OC、OPG和Runx2表达也有所下降。ELIAS分析结果显示，过表达miR-494减少了细胞分泌OC和OPG。在BMP-2诱导下，Runx2蛋白表达上调，但是转染miR-494后Runx2的上调被抑制。Osx是Runx2下游基因，我们发现在BMP-2诱导分化的C2C12细胞中过表达miR-494抑制了Osx的表达。另外，我们还发现在C2C12细胞中过表达miR-494后，其成肌分化的相关基因表达发生了上调，而miR-494对C2C12细胞成脂分化无明显作用。我们的研究表明，miR-494能抑制细胞的成骨分化。
　　4.miR-494通过调节Runx2、BMPR2和FGFR2的表达抑制成骨细胞分化。我们用生物信息学方法在包括miRanda、TargetScan、pictar和RNAhybriddatabases等在内的多个网站进行miR-494靶基因预测，得到可能的靶基因超过1,000个。我们进一步从中筛选出参与成骨细胞分化的靶基因30个，并将这些基因3’UTR克隆入荧光素酶报告载体，与miR-494mimics或N.C.共转染293A细胞，检测其相对荧光强度。结果发现，miR-494能显著抑制BMPR2、FGFR2和Runx23’UTR报告基因的荧光素酶活性，且抑制效率达到40-60％。相反地，突变掉这些基因上miR-494的结合位点后，miR-494对荧光素酶活性的影响消失，表明miR-494可以结合并作用于上述基因的3’UTR。WesternBlot和Real-timePCR结果显示，过表达miR-494明显抑制内源性BMPR2、FGFR2和Runx2的蛋白和mRNA表达。为了进一步确定miR-494是通过抑制BMPR2、FGFR2和Runx2的表达影响成骨细胞分化，我们合成了针对这3个基因的siRNA。将3种siRNA分别转染C2C12细胞72小时，成骨细胞特异基因表达下调，骨分化受抑制，其趋势与转染miR-494一致。我们的研究证明，miR-494通过直接下调和Runx2、BMPR2和FGFR2抑制成骨细胞的分化。
　　5.转录因子MyoD可能参与了对miR-494的表达调控。为了探讨miR-494转录调控机制，我们对miR-494上游序列进行了生物信息学分析。分析结果显示，距离pre-miR-4945’端2-3kb的上游序列在不同种属中有高度的保守性，提示这段序列可能参与了对miR-494的转录调控。进一步的分析表明该区域有多个Myod的结合位点，提示转录因子Myod可能参与了miR-494的转录调节。我们首先分析了模拟失重时，BMP-2诱导分化的C2C12细胞中Myod表达情况，发现随着失重时间的延长，Myod表达发生了上调，这与miR-494表达变化相一致。随后，我们在正常重力条件下培养的C2C12细胞中加入BMP-2，研究细胞分化过程中mi-494与Myod表达变化情况，Real-timePCR结果显示两者表达水平随诱导时间的延长同时下降。此外，我们还发现转染miR-494后，MyoD的表达水平也发生了上调。我们的研究初步显示了转录因子MyoD可能参与了对miR-494的表达调控。为了证实我们的推测，进一步的的相关实验还在深入进行中。
　　6.miR-494inhibitor能够部分缓解失重引起的成骨分化障碍。模拟失重时成骨细胞分化受抑制，miR-494表达升高。我们将针对miR-494的反义寡核苷酸，即miR-494inhibitor及其相应对照N.C.inhibitor分别转染C2C12细胞，同时加入300ng/mlBMP-2诱导分化，置于回转器模拟失重培养72小时，用Real-timePCR方法检测细胞成骨相关基因表达，发现抑制miR-494的表达能够使ALP染色增强，说明miR-494inhibitor能够增加骨形成能力，部分缓解失重引起的成骨分化障碍。
　　总之，我们发现miRNA参与失重性成骨细胞功能异常的发生。其中，我们对表达上调的miR-494功能和作用机制进行了较为全面的研究，发现在模拟失重时miR-494表达升高，而且与失重时间正相关。体外实验证明，miR-494通过降低其靶基因BMPR2、FGFR2和Runx2的表达参与成骨细胞分化。过表达miR-494抑制成骨相关基因的表达，从而抑制骨形成；降低内源性miR-494表达则促进成骨分化，并且能够部分缓解由于失重引起的成骨分化障碍。该研究将对预防和治疗失重性骨质疏松提供理论依据。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、成骨细胞分化过程及其调控机制

二、microRNA 在成骨分化中的作用

三、微重力对成骨细胞及其分化过程的影响

正文

一、 模拟失重条件下骨形成能力降低

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

二、 模拟失重能引起成骨细胞 miRNA 表达谱的改变

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

三、 miR-494 抑制成骨细胞分化

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

四、 miR-494 抑制 Runx2、BMPR2、FGFR2 的表达

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

五、 Myod 可能参与 miR-494 的表达调控

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

六、 miR-494 inhibitor 能够部分减弱模拟失重引起的成

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢