利用家系相关性分析方法探讨原发性胆汁性肝硬化的基因易感性

摘要

背景:
　　原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种自身免疫性肝脏疾病,主要是由免疫紊乱介导，引起慢性进行性非化脓性胆管炎，以肝内小胆管损伤和汇管区淋巴细胞浸润为主要特征，进而发生肝内胆汁淤积，最终导致肝纤维化和肝硬化。随着人们对PBC的认识和诊疗水平的提高及自身抗体检测技术的广泛应用，PBC发病率呈逐年增高的趋势。然而大多数病人在早期无症状，发现时已属肝硬化的晚期，因此早期诊断早期治疗对PBC患者具有非常重要的意义。但是PBC的发病机制尚不明确，近年来流行病学调查研究显示PBC发病呈明显的家族聚集现象。
　　不同国家流行病学研究显示PBC一级亲属的PBC患病率在1.0％-7.1％之间，而正常群体PBC患病率仅为0.001％-0.2％，一级亲属PBC的患病率明显高于正常人群的PBC患病率；PBC在同卵双胞胎中的共患病率高达63％；PBC患者一级亲属其中有61％发现有免疫异常，有14％合并有其他自身免疫性疾病。这三方面的资料说明PBC发病具有明显的家族聚集现象，提示基因易感性与PBC的发病密切相关。目前主要认为其发病机制是基因易感性与环境因素相互作用的结果。
　　同时，PBC发病机制与免疫调节紊乱密切相关，尤其与T细胞阳性选择及Th1细胞增殖、分化异常甚为密切，其信号通路包括IL-12信号通路、Th1分化信号通路等。其中参与T细胞增殖、阳性选择的分子包括CTLA-4、PTPN22以及MHC类分子。参与Th1细胞分化的分子包括IL-12、STAT4、IRF5、INF-γ及Tyk2。
　　目的:
　　利用家系相关性分析方法探讨原发性胆汁性肝硬化的基因易感性。主要针对免疫调节相关基因即与Th1细胞分化信号通路密切相关的单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点进行研究，寻找与PBC发病密切相关的基因，为研究PBC的发病机制提供理论基础。
　　方法:
　　收集PBC家系（包括PBC患者及其一级亲属）血液样本，部分用于收集血清，部分用于DNA提取，储存并建立血清库及DNA库。用间接免疫荧光法、免疫印迹法对这些样本的血清库进行自身抗体的检测。利用芯片SNP的方法对DNA库基因SNP位点易感性进行检测。
　　结果:
　　共收集80个家系的血液样本300份，结合临床诊断及实验室检测，共确诊94例PBC患者与206例正常的一级亲属。本实验研究发现，80个PBC家系中，10个家系的一级亲属中诊断有PBC患者，得出PBC家系患病率为12.5％，明显高于正常群体PBC患病率。
　　在所有一级亲属中，发现14例在本实验研究中自身抗体检测异常，均为抗核抗体（antinuclear antibody,ANA）阳性，且间接免疫荧光结果表现为抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody,AMA)阳性,并且免疫印迹法测定ANA谱为抗线粒体抗体M2型（antimitochondrial antibody M2,AMA-M2）阳性在＋～＋＋＋＋。初步筛查认为此14例一级亲属为可疑PBC患者，结合进一步临床诊断，最终均确诊为PBC患者。
　　利用家系相关性分析方法，对IL-12RB2基因上三个SNP位点(rs3790567,rs3790565,rs6679356)和STAT4基因上三个SNP位点(rs6748358,rs16833239,rs7574865)进行分析。得出位于IL-12RB2上的rs3790567位点和位于STAT4上的rs6748358位点与PBC密切相关。
　　结论:
　　本实验获得我国人群中PBC家系患病率约为12.5％，充分说明了PBC具有明显的家族聚集性。IL-12RB2基因上的rs3790567位点A等位基因和位于STAT4基因上的rs6748358位点T等位基因，在病人与其一级亲属之间有显著差异，这两个位点可能与PBC易感性密切相关。PBC发病可能与Th1分化信号通路高度相关。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 PBC 的诊断标准

二 PBC 的发病机制

三 遗传变性和 PBC 易感性

四 PBC 的治疗进展

正文

实验一 纳入研究对象的 PBC 患者诊断及其一级亲属的筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 SNP 的检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢