DJ-1在黑素细胞抗氧化应激中的作用研究

摘要

白癜风是一种临床上常见的色素脱失性皮肤病，其发病机制目前仍不完全清楚，其中涉及遗传背景、氧化应激、自身免疫、精神神经等多种因素。近年来研究发现氧化应激在白癜风发病中发挥重要作用。
　　正常情况下，皮肤氧化-抗氧化系统处于动态平衡状态，而白癜风患者中这一平衡被打破。有学者发现，在进展期白癜风患者表皮中H2O2浓度可高达为10-3M，远远高于正常人的10-7M-10-6M生理浓度。高浓度的H2O2诱导了白癜风的发生并促进了白癜风的发展。
　　DJ-1/PARK7基因编码DJ-1蛋白，发现于1997年，曾被认为是癌基因。目前的研究发现其具有多种生物学功能：包括促进细胞增殖，参与雄性精子成熟与受精，抵抗氧化应激等。随着研究的深入，其抗氧化应激功能日益被重视。但DJ-1在黑素细胞中是否表达及其功能如何尚未见报道。
　　本试验以人原代培养黑素细胞为对象，采用H2O2诱导氧化应激和siRNA干涉技术观察DJ-1基因对细胞形态、增殖活力、细胞内ROS产生及凋亡的影响，以验证其对黑素细胞是否具有抗氧化应激保护作用。
　　第一部分实验：DJ-1在黑素细胞内的表达鉴定、H2O2适宜浓度及DJ-1特异性有效siRNA序列筛选
　　1.主要方法
　　采用免疫荧光方法鉴定DJ-1在原代培养黑素细胞中的表达；使用不同浓度H2O2处理黑素细胞24h，改良MTT法检测细胞活性，选取适宜浓度H2O2作为后续实验条件；设计并合成三对DJ-1特异性siRNA，反向转染原代培养人黑素细胞，实验分组包括空白对照组（不含siRNA），阴性对照组（转染阴性对照siRNA-negativecontrol）及实验组（转染siRNA-DJ-1），于转染后24h及48h分别行Q-RT-PCR及Westernblot检测DJ-1mRNA及蛋白表达情况，筛选干涉效率最高的siRNA片段。
　　2．主要结果
　　免疫荧光显示DJ-1在细胞核和胞质中均表达，以细胞核表达为主；细胞活力随H2O2浓度增高呈剂量依赖关系下降，0.5mMH2O2处理24h后，细胞活力开始下降(P<0.05vscontrol)，此浓度作为诱导氧化应激的实验条件；Q-RT-PCR及Westernblot结果显示siRNA-DJ-1-687对靶基因的抑制效果最好。与对照组相比，转染了DJ-1-siRNA-687的细胞组DJ-1mRNA及蛋白表达量均明显降低(P<0.05vscontrol)。
　　3.主要结论
　　本部分实验证实DJ-1表达于人黑素细胞中，筛选出了适宜处理浓度的H2O2及最有效的siRNA-DJ-1序列，为后续的实验打下基础。
　　第二部分实验：DJ-1通过降低细胞内ROS和抑制细胞凋亡保护黑素细胞抵抗H2O2诱导的氧化应激损伤
　　1.主要方法
　　用0.5mMH2O2处理黑素细胞24h后，Q-RT-PCR和Westernblot检测DJ-1mRNA和蛋白表达变化情况；使用siRNA-DJ-1-687反向转染原代培养黑素细胞，设空白对照组（不含siRNA），阴性对照组（转染阴性对照siRNA-NC）及实验组（转染siRNA-DJ-1）。细胞贴壁后，光学显微镜观察细胞形态学差异；转染48h后，使用0.5mM的H2O2处理三组黑素细胞24h，改良MTT法、荧光探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)分别检测细胞活力变化、细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平及细胞凋亡比例。
　　2.主要结果
　　0.5mMH2O2处理细胞24h后，处理组DJ-1表达增高为对照的2.23倍(P<0.05vsuntreated)；干涉DJ-1表达，细胞贴壁后，siRNA-DJ-1组黑素细胞形态与对照组相比，树突减少缩短，胞浆空泡化改变；使用0.5mMH2O2处理24h后，siRNA-DJ-1组细胞活力为对照组的35％(P<0.05vscontrol)；细胞内ROS的fluorescenceintensity(FI)值(902±40)和凋亡比例(58％±6.1％)增高，与对照组细胞内ROS的FI值(529±32)和凋亡比例(30％±3.8％)相比，P值均<0.05；
　　3.主要结论
　　我们的研究证实在H2O2所诱导的氧化应激下黑素细胞中DJ-1表达增高，从而发挥其保护作用，DJ-1在黑素细胞中能够通过降低细胞内ROS水平和抑制细胞凋亡来抵抗H2O2所诱导的氧化应激损伤。此外，即使在无外源性氧化应激存在时，DJ-1表达被抑制后黑素细胞出现树突缩短、空泡化等改变，提示DJ-1在黑素细胞生理及病理状态中具有重要作用。

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文献回顾

第一部分 氧化应激与白癜风研究进展

1. 皮肤氧化-抗氧化系统

2. 诸多证据表明白癜风患者全身和局部表皮中，均存在氧化-抗氧化失衡[2-4]。

3. 氧化应激相关基因易感性与白癜风

第二部分 DJ-1 抗氧化应激功能研究进展

1. DJ-1 基因与蛋白

2. 抗氧化应激功能研究

3. DJ-1 抗氧化应激的机制

第一部分实验：DJ-1 在黑素细胞内的表达鉴定、H2O2适宜浓度的选择及DJ-1 有效的特异性siRNA序列筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分实验：DJ-1 通过降低细胞内ROS和抑制细胞凋亡保护黑素细胞抵抗H2O2诱导的氧化应激损伤

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢