利用细胞膜片技术构建牙髓、牙周膜干细胞间微环境的实验研究

摘要

牙髓干细胞（DPSCs）和牙周膜干细胞（PDLSCs）是重要的牙齿组织工程种子细胞。与其他牙源性种子细胞（如SHEDs、SCAP、DFSCs等）相比，具有获取方法简单、不受患者年龄因素制约、组织存储量大且创伤较小等优点。DPSCs和PDLSCs的高增值率、多向分化潜能及可联合应用修复牙体牙周组织功能的特点使其成为牙组织工程和未来临床治疗潜能巨大的牙源性成体干细胞。本实验采用细胞膜片技术进行牙组织工程研究，建立牙周、牙髓条件培养液与DPSCs、PDLSCs共培养体系，检测两种细胞微环境对细胞形态功能的影响，进一步利用细胞膜片技术构建DPSCs、PDLSCs-HA/TCP支架复合体进行体内组织学研究，为牙组织工程再生探索新的方法途径。
　　第一部分：用牙周膜干细胞（hPDLSCs）制备牙周膜细胞片
　　联合采用酶消化法和组织块法获取原代细胞，采用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况。将第四代牙周膜细胞接种到培养皿中，经五周连续培养可形成具有机械加工性能的牙周细胞生物膜片，将此细胞膜片包裹HA/TCP支架植入裸鼠皮下，4周后取材进行组织学检测。本部分实验结果表明：牙周膜干细胞生长状态良好，每层细胞首尾重叠，规则排列，各层间细胞紧密相连。组织学检测显示，颗粒状羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）支架外附着由多层成纤维样细胞组成的牙周膜样组织，并可见毛细血管从中穿行，支架材料与类牙周膜组织之间有类牙骨质样结构形成。
　　第二部分：牙髓干细胞（DPSCs）及牙周膜干细胞（PDLCS）微环境的相互作用的研究
　　分离培养牙髓干细胞、牙周膜干细胞备用，制备牙髓干细胞条件培养液和牙周膜干细胞条件培养液。将两种细胞各自分别在两种条件培养液中培养，分为四组。对四个实验组细胞进行倒置显微镜形态学观察、MTT细胞增殖检测、ALP活性检测、实时定量PCR检测，其中培养牙髓干细胞的两组检测DSP、ColI、ColIII基因；培养牙周膜干细胞的两组检测ColI、OCN、scleraxis基因。检测结果表明：经牙周膜细胞条件培养液培养的牙髓干细胞其细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性及DSP、ColI、ColIII的表达水平均高于经牙髓细胞条件培养液培养的牙髓干细胞；经牙髓细胞条件培养液培养的牙周膜细胞其增殖活性、碱性磷酸酶活性及ColI、OCN、scleraxis却低于经牙周膜细胞条件培养液培养的牙周膜干细胞。本部分实验拟探讨两种干细胞及其微环境相互之间的作用影响，实验结果说明牙周膜细胞条件培养液的微环境促进了牙髓细胞的增殖和分化，而牙髓细胞条件培养液的微环境却对牙周膜细胞的增殖和分化有抑制的作用。
　　第三部分：构建牙周膜细胞膜片-DPSCs-HA/TCP复合体的体内实验研究
　　将复合有牙髓干细胞的HA/TCP支架置于生物反应器中培养10日，在其表面包裹牙周膜细胞膜片后，将此复合物移植入免疫缺陷小鼠皮下培养。六周后取材，组织学显示HA/TCP支架外侧有牙周膜样组织形成，支架外表面及内部空隙表面有牙髓干细胞分泌的矿化基质形成，但外表面的矿化基质远远多于内部孔隙表面的矿化基质；牙周膜样组织相接触的牙髓细胞分泌出大量矿化基质，胞核大且深染；而与其相邻的没有与牙周膜样组织接触的牙髓细胞几乎没有矿化现象。组织学染色进一步验证了牙周膜干细胞对牙髓细胞的诱导和促进作用。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 牙体、牙周组织工程的构建

二、牙组织工程种子细胞（Mesenchymal stem cells and tooth engineering）

三、牙组织工程影响因素

正 文

第一部分：构建组织工程牙周细胞膜片的实验研究

实验一 人牙周膜细胞的分离培养及组织工程牙周膜细胞片的体外构建筛选

实验二、组织工程牙周膜细胞片的异位移植

第二部分 牙髓细胞及牙周膜细胞微环境相互作用的实验研究

1 材料 7500 型荧光定量 PCR 仪

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分：牙周膜细胞膜片-DPSCs-HA/TCP 复合体的体内实验研究

1 材料 7500 型荧光定量 PCR 仪

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢