肌质网Ca2+转运功能在骨骼肌强直收缩疲劳与恢复中的作用

摘要

骨骼肌是运动系统的重要组成部分，其功能的完整及保持对于机体的运动能力具有至关重要的意义。骨骼肌在保持张力大小和收缩速度相对恒定一段时间后，其输出功率会发生降低，做功能力下降。骨骼肌疲劳的最主要特征之一就是张力降低、收缩速度减慢和舒张时间延长。这对于机体运动能力的损害是显而易见的，尤其是在跑步、上下楼等需要骨骼肌维持较强运动功能的活动中极易造成严重后果。导致骨骼肌疲劳的机理非常复杂并涉及到了诸多代谢性或非代谢性的因素，尽管目前已普遍认为肌质网(sarcoplasmicreticulum，SR)对Ca2+释放与摄取功能的变化在其中起到了关键性的作用，但其具体机理尚未阐明。骨骼肌疲劳性增加会限制正常的运动能力；老龄人骨骼疲劳性增加是导致老年人行走容易摔倒且并发骨折、甚至生活不能自理的主要原因；在长期太空停留过程中机体也面临着抗重力骨骼肌疲劳性增加带来的危害。探明骨骼肌疲劳性增加的明确机理，可为建立减轻骨骼肌疲劳、加快运动功能恢复的有效措施奠定基础，对于保护骨骼肌运动能力和促进中长期载人航天活动开展具有重要的意义和影响。
　　为此，本研究以骨骼肌疲劳与恢复过程中肌质网Ca2+转运功能变化为主要目标，建立了离体骨骼肌条电刺激方案，应用离体骨骼肌条收缩功能测量、SERCA酶活性测量技术、蛋白印迹技术等方法，观测了正常大鼠、尾部悬吊大鼠、甲亢大鼠比目鱼肌疲劳和疲劳恢复过程中重要收缩功能参数的变化及其异同，初步探讨了导致上述变化的可能机理。主要研究结果为：
　　1.离体比目鱼肌肌条收缩功能实验适宜的电刺激条件本研究表明，大鼠比目鱼肌条在离体条件下对电刺激的电压、刺激持续时间、刺激频率呈现显著的依赖性。在电压8～20V之间、电刺激持续200μs～5ms之间、刺激频率20～80Hz之间规律性较为显著。而刺激电压变化对比目鱼肌肌条的最适刺激频率并未产生明显影响。
　　2.疲劳期间与疲劳恢复过程中TR75延长比值可以作为评判肌质网Ca2+释放功能的间接指标在20V电压刺激作用下，疲劳性间断强直收缩期间，对照组比目鱼肌肌条TR75延长比值为2.6倍；采用5mmol/L咖啡因灌流时，增加肌质网Ca2+释放功能后，TR75延长比值亦达3.0倍，较对照组明显增大。采用5mmol/LMg2SO4灌流15min或60min后，在抑制了肌质网Ca2+释放功能的情况下，TR75延长比值均为2.1倍，较对照组显著减小。此外，工作负荷为30％，刺激电压20V，刺激频率100Hz作用时，此时肌质网Ca2+释放功能达到最大，疲劳性强直收缩期间TR75延长比值为2.5倍；进一步增加刺激频率至120Hz和140Hz时肌质网Ca2+释放功能无法再增加，TR75延长比值为分别为2.7倍和2.3倍。三组均值间无显著性差别。在疲劳恢复过程中，第5min和第10min时肌质网Ca2+释放功能尚未完全恢复，TR75延长比值分别为1.4倍和1.9倍，与第一次相比显著缩短，在第60min时肌质网Ca2+释放功能完全恢复，其比值为2.4倍，与第一次无显著差异。采用增加或减少肌质网Ca2+释放观测TR75变化的方法，表明TR75与肌质网Ca2+释放增加或减少存在明确的对应关系，可作为评价肌质网Ca2+释放功能的间接指标。
　　TR75分别延长了9.7％,53.4％,和121.6％，悬吊组延长了9.3％,55.6％,和117.5％。与对照组相比，悬吊组比目鱼肌强直收缩的TR75降低了38％。与未采用CPA灌流组相比，1-，2-，5-μmol/LCPA灌流后对照组比目鱼肌强直收缩的TR75s分别延长了19.3％,52.7％,和70.5％。值得注意的是，悬吊组TR75分别延长了7.6％,37.4％和73.1％。
　　6.温度对对照组比目鱼肌张力降低和收缩时程的影响将27°C灌流液温度条件下单次收缩的TPT和TR75值设定为100％。在22°C时，TPT和TR75分别增加了50％和70％，但是在35°C，却分别减少了37.5％和52.3％。间断强直收缩时张力在22°C大于27°C，然而在35°C时却大大低于27°C。对照组大鼠比目鱼肌在22°C时，强直收缩TR75平均值是345ms,在27°C和35°C时均显著缩短。此外，35°C灌流条件下，无论是对照组还是悬吊组比目鱼肌，活性氧簇清除剂Tiron(5.0mmol/L)对第5min最大张力降低速度并无明显作用。
　　7.咖啡因、灌流液Ca2+浓度、A23187对间断强直收缩张力降低速度的影响1.0或5.0mmol/L咖啡因对对照组或悬吊组比目鱼肌张力降低速度均无影响。与采用2.25mmol/LCa2+灌流相比，将灌流液Ca2+浓度提高到3.5mmol/L，强直收缩张力呈现增高的趋势，尽管无显著的统计学差异。使用1.0μmol/LA23187灌流后，对照组与悬吊组比目鱼肌的强直收缩张力均显著增加。
　　8.去负荷比目鱼肌收缩对细胞外Ca2+依赖性增加用不含Ca2+的灌流液灌流后，随着收缩时间的延长，对照组大鼠比目鱼肌仍能够较好地维持初始张力，而悬吊组大鼠比目鱼肌从第5min左右开始张力出现明显降低，并随时间的延长而逐渐加重，至20min时，最大张力降低至初始张力的82.8±5.7％，而此时，对照组张力仍保持在初始张力的95.6±2.6％。用含2.25mmol/LCa2+的灌流液恢复灌流后，去负荷比目鱼肌张力增高程度显著高于对照组。在第20min时，对照组比目鱼肌张力仅呈现轻度增加趋势，而去负荷组比目鱼肌张力自第5min开始就明显增加，至第20min时，张力增加到初始张力的147.4±9.66％。
　　9.去负荷比目鱼肌DHPR与RyR表达水平的变化悬吊4周组比目鱼肌DHPR的?1c亚基表达显著高于同步对照组；DHPR?1s亚基的表达与同步对照组相比呈现明显降低趋势，且悬吊4周组显著低于悬吊2周组。与同步对照组相比，去负荷4周比目鱼肌DHPR?1s亚基的表达量与DHPR表达总量相比显著降低，且显著低于悬吊1周和悬吊2周组。与同步对照组相比，悬吊2周、4周组比目鱼肌中RyR表达水平明显降低，与EDL和心肌中的表达水平相当的水平接近。
　　综上所述，肌质网Ca2+释放功能和SERCA活性均对骨骼肌收缩功能，尤其是与疲劳特性紧密相关的张力、收缩时程等参数具有重要的影响，能够调节骨骼肌对疲劳的抵抗性，并且这种复杂的调节作用可能具有双向性。去负荷比目鱼肌疲劳性增加可能是由于DHPR与RyR表达水平改变，进而通过兴奋-收缩脱耦联影响肌质网Ca2+转运功能。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、骨骼肌疲劳的定义、特征与测量方法

二、骨骼肌疲劳的分子机制

三、肌质网在骨骼肌疲劳中的作用

四、存在的问题与假说

正文

实验一离体大鼠比目鱼肌收缩功能的电刺激方案

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二骨骼肌肌条肌质网 Ca2+释放功能的间接测量方法

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

实验三甲状腺功能亢进大鼠比目鱼肌SERCA 活性增高可能加速强直收缩疲劳

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

实验四去负荷比目鱼肌 SERCA 活性受抑制后可延缓间断强直收缩张力的降低

1 引言

2 材料与方法：

3 结果

4 讨论

实验五去负荷比目鱼肌 Ca2+通道表达水平的变化

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢