TNF拮抗剂治疗对RA患者外周血Th亚群的影响及其机制的研究

摘要

目的：
　　类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是以滑膜炎症和关节软骨及骨破坏为特征的全身性慢性自身免疫病，以炎性细胞在关节滑膜处浸润，滑膜增生，血管翳形成，关节软骨及骨的持续破坏为特征，研究表明T细胞尤其是辅助性T细胞（Thelpercell,Th）在RA的发病及进展中可能发挥着重要作用。在过去的几十年里，RA被认为是由Th1细胞介导的自身免疫病。Th1的细胞表型与炎症有关，而与之相对的Th2细胞在某种程度上可以抗炎症。Th1/Th2失衡可产生过量的（肿瘤坏死因子）TNF-α，TNF-α诱发的级联反应导致炎症的迁延以及关节软骨和骨的破坏。
　　近年来，两群新的Th细胞亚群——Th17和调节性T细胞的发现，打破了以往仅以Th1/Th2失衡模式解释RA的发病及进展，深入探讨Th亚群细胞及其相互关系将有助于运用促炎/抗炎细胞平衡概念全新的了解包括RA在内的自身免疫病的发病机制，并为这些自身免疫病的治疗开拓了新的领域。
　　近10年余来靶向免疫炎性细胞或分子的生物制剂的应用，开启了RA治疗新纪元。依那西普（etanercept）、英夫利西单抗（infliximab）及阿达木单抗等抗TNF-α药物已广泛应用于临床，对多数中、重度活动性RA具有明显改善病情和改善预后的效果。但令人关注的是，尚有一部分患者不能达到理想的治疗效果。
　　鉴于Th细胞亚群失衡及其相关细胞因子网络和“瀑布效应”的异常是RA发病及病情进展的重要机制，作为T细胞分化和应答上游和下游调控的TNF-α的消长必然在此机制中发挥重要作用。那么RA患者Th细胞亚群失衡的严重程度是否会影响TNF-α拮抗剂的治疗效果，使用TNF-α拮抗剂治疗后其体内Th细胞亚群及细胞因子是否能够重新分布从而达到失衡逆转及免疫稳态的维持，这一改变与疾病的转归和预后是否存在联系，如果存在联系，是否可以通过对患者免疫状态的评估来预测患者的治疗反应和预后，对RA患者Th细胞亚群的深入研究是否能发现新的治疗靶点，这些都是需要密切关注的问题。
　　因此，本研究旨在建立稳定的Th亚群细胞检测技术的基础上：1.进一步证明RA发病过程中体内存在的Th细胞亚群及其相关细胞因子之间失衡状态并观察患者在接受抗TNF-α药物治疗后体内失衡状态的改善及与疾病缓解程度的相关性；2.研究疾病不同病程阶段及不同活动度时体内Th细胞亚群及其相关因子的分布状况，尤其研究Th17细胞在不同病期和不同疾病活动度时炎症表型和趋化因子表达的情况；3.研究对抗TNF-α治疗效果不同的患者其体内治疗前后体内T细胞亚群分布及炎症表型的表达情况，探讨抗TNF-α治疗效果不佳或复发的可能机制，为临床用药提供参考。
　　方法：（分三部分）
　　1．依那西普对RA患者外周血Th1/Th2,Th17/Treg及相关因子的影响
　　选取门诊或住院治疗的诊断明确的活动期RA患者20例，随机分为2个研究组：联合治疗组，每组10例，给予MTX7.5～15mg口服，每周一次，同时给予皮下注射ETA每次25mg，每周2次；MTX单药治疗组，单用MTX7.5～15mg治疗，口服，每周一次。两组疗程均为12周。另外选取10名年龄、性别与研究病例匹配的健康体检者作为健康对照；用疾病活动度评分（DAS28）评估患者治疗前后病情活动情况；采用流式细胞术检测患者外周血中Th1、Th2、Th17和调节性T细胞（Treg）占CD4+T细胞的百分比，比较治疗前后Th1/Th2、Th17/Treg平衡在治疗前后的变化及其与疾病改善程度的相关性；用ELISA检测患者外周血血清中炎性细胞因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17,、IL-23及抗炎细胞因子TGF-β、IL-4、IL-10的表达在治疗前后的消长及其与Th细胞平衡变化的相关性。
　　2．对不同病期及不同活动程度RA患者外周血中Th细胞亚群表型和转录因子的研究
　　选取门诊或住院治疗的诊断明确的早期RA（病程＜1年)患者41例，既往RA（病程≥1年）患者50例，上述患者根据疾病活动程度又分为低活动度（DAS28≤2.6）和中到重度活动度（DAS28≥3.2）两组；运用流式细胞术胞内及胞外染色方法检测所有RA患者胞内因子IFN-γ、IL-17、RORc、Foxp3的表达及Th17细胞上CCR6、CCR4、IL-23R的表达；使用real-timeRT-PCR法测定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表达量。
　　3．研究TNF-α拮抗剂治疗对RA患者外周血中Th细胞亚群表型和转录因子的影响
　　对2008年12月至2009年12月期间门诊或住院的诊断明确的接受TNF-α拮抗剂治疗的所有同意签署知情同意书的RA患者进行为期12个月的随访和观察，从中选取了15例治疗12个月（不伴随其他DMARDs）后达到ACR50缓解标准的患者，选取10例治疗后（不伴随其他DMARDs）未达到ACR20缓解标准的患者进行数据统计研究。所选的两组患者在年龄、性别、病程上没有显著差异，且所有患者在使用TNF-α拮抗剂治疗前疾病严重活动（DAS28＞5.1）。所有患者每个月随访一次，进行病情评估和相关实验室检测；利用流式细胞术检测患者治疗前后外周血中Th1、Th2、Th17和Treg占CD4+T细胞的百分比，检测胞内因子IFN-γ、IL-4、IL-17、RORc的表达及Th17细胞上CCR6,CCR4,IL-23R的表达；使用real-timeRT-PCR法测定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表达情况。
　　结果：
　　1.开始治疗前，两组患者外周血中的Th1细胞和Th17细胞占CD4+T细胞比例均显著比正常人高（分别p＜0.05，p＜0.001），但Treg细胞的百分比显著低于正常人（p＜0.005），而Th2细胞在三组之间没有显著差异。经12周治疗后，ETA+MTX联合治疗的患者Th1和Th17占CD4+T细胞百分比显著下降（分别p＜0.05，p=0.007），Treg细胞百分比显著升高（p=0.033），而对单独MTX治疗的患者，各个细胞均无明显差异。Th2细胞在两组患者中均没有明显变化。
　　所有RA患者治疗12周后，其Th17与Treg的比值都显著下调，提示RA患者体内Th17与Treg之间的平衡有所逆转，而Th1和Th2之间的失衡却没有明显变化。
　　将治疗前后DAS28的变化(ΔDAS28)作为疾病改善程度的指标，采用Spearman相关性分析，发现使用MTX单独治疗的患者，其疾病改善程度(ΔDAS28)与Th1/Th2平衡和Th17/Treg平衡的逆转都没有相关性，在MTX+ETA联合治疗的患者，虽然其疾病的改善同Th1/Th2平衡的逆转没有明显的相关性，但与Th17/Treg平衡的逆转有很强的相关性。
　　接受ETA+MTX联合治疗的患者，其血清中前炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23的表达量均较治疗前有显著下降，而抑炎因子TGF-β的表达显著上升。在MTX单独治疗组，并未发现这些细胞因子的表达有显著变化。ETA+MTX联合治疗的患者，其外周血中Th17/Treg平衡同血清中IL-6的水平呈负相关关系而与TGF-β的水平呈正相关关系。
　　2．早期患者不管病情活动与否，体内都有较高水平的IL-17+Th17细胞（p＜0.05)，而既往患者体内却有较高表达水平的IFN-γ+Th1细胞（p＜0.05)。早期患者体内CCR4+CCR6+T细胞和CCR4+CCR6-T细胞都较中晚期患者高（p＜0.05)，且CCR4和CCR6在CD4+T细胞上的双阳性表达同体内分泌IL-17的Th17细胞百分率密切相关（r=0.972，p＜0.001)，而只表达CCR4可能与IFN-γ的分泌有关（r=0.625,p＜0.05)，只表达CCR6的细胞可能既可以分泌IFN-γ，也可分泌IL-17（r=0.619,p＜0.05)。
　　疾病活动时Th17上CCR6的表达比低活动度患者显著升高（p＜0.05)，且早期活动患者Th17细胞上表达的CCR6比中晚期活动患者显著升高（p＜0.05)。CCR4在Th17细胞上的表达在各组RA患者之间没有显著差异。对RORc的表达，早期RA低活动度患者显著高于中晚期低活动度患者（p＜0.05)，但显著低于早期疾病中重度活动的患者（p＜0.05)，中晚期患者疾病活动时表达显著高于低活动度时（p＜0.05)。早期RA患者疾病中重度活动时Th17细胞上表达的IL-23R显著高于低活动度时，而对中晚期患者没有显著差异，不论患者疾病是否活动，IL-23R在Th17细胞上的表达在早期患者都更显著（p＜0.001)。
　　早期RA患者疾病中重度活动时，Foxp3占CD4+CD25highTreg的百分率显著低于活动度低时（p＜0.05)，并且不论疾病活动与否，中晚期患者外周血中Foxp3表达率均显著低于早期患者（p＜0.05)。
　　转录因子T-betmRNA在各组患者中分子水平的表达并没有显著差异。RORc及Foxp3mRNA的表达在早期患者没有显著差异，但在中晚期患者，疾病活动与不活动患者的表达存在差异，表现为RORcmRNA在中重度活动患者表达显著升高（p＜0.05)，而Foxp3mRNA表达显著下降（p＜0.05)。
　　3．经TNF-α拮抗剂治疗后，Th1占CD4+T细胞百分比均没有明显减少，而Th17细胞占CD4+T细胞百分比显著降低，且在达到ACR50反应标准的患者中降低更明显，Treg细胞在达到ACR50反应标准的患者中显著升高，而对于治疗反应差（未达到ACR20缓解）的患者，Treg细胞并没有显著升高。
　　达到ACR50标准的患者，其外周血中IFN-γ+IL-17-T细胞及IFN-γ-IL-17+T细胞占CD4+T细胞的百分率均较治疗前有明显下降，而未达到ACR20标准的患者，其外周血中的IFN-γ+IL-17+T的百分率相比治疗前有所升高且有统计意义，IFN-γ+IL-17-T细胞也升高但无统计意义。
　　达到ACR50标准的患者，其CCR4、CCR6及IL-23R的表达均比治疗前有显著下降，且其中CCR4+CCR6+T细胞和CCR4-CCR6+T细胞数量显著下降，同时转录因子RORc的表达率也显著下降，而对未达ACR20标准的患者，上述细胞炎症表型的表达均无显著变化。
　　达到ACR50标准的患者，其外周血中RORcmRNA的表达比治疗前显著降低，而Foxp3mRNA的表达显著升高；而对未达到ACR20的患者，RORc及Foxp3mRNA的表达均无显著变化，相反，T-betmRNA却有统计意义的上升。
　　结论：
　　在建立了成熟、稳定的T淋巴细胞亚群的检测方法，掌握多种胞内因子染色的流

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声明

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

一、T 淋巴细胞在类风湿关节炎中的作用

二、细胞因子在 RA 发病中的作用

三、类风湿关节炎治疗进展概况

正文

第一部分 依那西普对 RA 患者外周血中 Th1/Th2, Th17/Treg 细胞亚群及其相关因子的影响

1 主要试剂与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 对不同病期及不同活动程度 RA 患者外周血中 Th 细胞亚群表型和转录因子的研究

1 主要试剂与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 TNF 拮抗剂治疗对 RA 患者外周血 Th细胞亚群表型和转录因子的影响

1 主要试剂与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢