表达外源hEGF基因HaCaT细胞生物学特性及其诱导皮肤附件转化的研究

摘要

【研究背景】
　　大面积深度烧伤后，由于供皮区缺乏，导致创面修复困难[1]，给患者留下了严重的伤残。为此，人们在解决大面积烧伤后皮源短缺的问题上已经探索了很长时间，然而传统的方法，比如：自体网状皮、大张异种皮开窗嵌入自体微型皮片、微粒皮以及自体表皮细胞培养扩增后移植等虽然一定程度上解决了一些问题，但是这些方法面临着一个共同的不足：不同程度的瘢痕形成致外观不佳、畸形严重致功能障碍等[2-5]。对此，近年来人们开始构建组织工程学皮肤以期望解决这个问题，从最初由Burk和Yannas设计的人工真皮到现在美国FDA批准用于临床的含有人体活细胞皮肤替代品Apligraf的发展，证明了构建组织工程皮肤的可行性，虽然这些产品还面临一些缺点：缺少汗腺及毛囊等皮肤附属器官（附件）而难以获得正常皮肤所应具有的外观及生理功能[6]。大面积深度烧伤病人修复创面无毛发，尤其是无汗腺，则不仅影响美观，更严重地影响创面愈合后的生活质量；因此，重建皮肤附件已成为皮肤组织修复领域的重要课题。本课题以表皮干细胞（ESC）为种子细胞，鼠尾胶原作为支架材料，借助对皮肤附件汗腺及毛囊形成有重要诱导效应的表皮生长因子（由本实验室构建的hEGF基因转染HaCaT细胞分泌）及真皮成纤维细胞和脂肪干细胞，作为ESC增殖分化的因子，构建组织工程皮肤。以探索人体ESC分化为皮肤附件汗腺、毛囊的可能性，并分析探讨其分化机制。
　　【研究目的】
　　1、观察本实验室已经构建的表达质粒pcDNA3.1-hEGF转染HaCaT细胞的形态学、增殖、分泌EGF免疫表型等生物学特性。
　　2、探索高效分离和培养人ESC方法，观察其生物学特性，并行形态学、免疫表型等鉴定。
　　3、探索不同方法、条件对构建以ESC为种子细胞的组织工程皮肤生物学影响。
　　4、利用表皮（干）细胞复合细胞化真皮的体外培养模型，对皮肤附件的体外表型转化进行探索性研究。
　　【研究内容】
　　1、对本实验室已经构建的hEGF基因转染HaCaT细胞进行形态学、增殖、分子表型等生物学特性。
　　2、分离、培养表皮干细胞，观察其形态学特征、测定其增殖曲线及分子表型鉴定。
　　3、分离、培养脂肪干细胞，观察形态学特征，成骨、成脂诱导分化，流式细胞仪分子表型鉴定。
　　4、建立稳定的三维立体组织工程皮肤，观察EGF对其生物学影响。
　　5、观察外源性EGF诱导ESC复合组织工程真皮向汗腺转化的趋势。
　　【研究结果】
　　1、hEGF转染HaCaT细胞具有高分泌EGF，HaCaT细胞稳定转染EGF基因后，经分子表型鉴定，K19、整合素-β1表达量升高。
　　2、利用改良方法可获得大量活性较高的ESC。分子表型鉴定其高表达K19、整合素-β1。
　　3、分离、培养ADSCs。流式细胞仪检测CD29、CD90、CD105阳性表达；CD31、CD43、CD45阴性表达。成骨、成脂诱导分化后，ADSCs分别呈现骨细胞、脂肪细胞的表性特征。
　　4、以ESC作为种子细胞，鼠尾胶原为支架，EGF作为生长因子构建三维组织工程皮肤，组织切片显示其分为三层，具有皮肤组织的基本特点。
　　5、构建组织工程皮肤经RT-PCR检测，其汗腺细胞表面抗原CK19、CEA的mRNA水平上升。
　　【研究结论】
　　1、hEGF转染HaCaT细胞具有高效稳定分泌EGF，分子表型鉴定hEGF转染HaCaT细胞具有表皮细胞的一般生物学特性。
　　2、利用改良、分离培养方法可获得大量活性较高的ESC，具有ESC的一般生物学特性。
　　3、酶消化法可有效分离纯化人ADSCs,细胞生长稳定、增殖能力活跃，具有ADSCs的一般生物学特性。
　　4、以ESC作为种子细胞，鼠尾胶原为支架，EGF作为生长因子可稳定构建三维组织工程皮肤，其结构接近生理皮肤构造。
　　5、EGF可能诱导ESC复合组织工程真皮向皮肤附件（汗腺）转化，并起着决定性的作用。

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缩略语表

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文献回顾

一、表皮干细胞的研究进展

二、脂肪干细胞的研究进展

三、 组织工程皮肤的研究进展

正 文

实验一 表达外源 hEGF 基因 HaCaT 细胞的生物学特性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 人表皮干细胞改良培养与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 构建组织工程皮肤及其皮肤附件转分化的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢