Ndrg2在小鼠胚胎及出生后脑组织神经发生区的表达特点

摘要

Ndrg2基因是本课题组用消减杂交法从人脑内克隆得到的一个抑癌基因，它定位于染色体14q11.2，mRNA全长2024bp，编码357个氨基酸，分子量约为43KD的蛋白质，1999年，再次分离到人Ndrg2另一种亚型，编码含有375个氨基酸残基。Ndrg2定位于细胞胞浆，也报道定位于胞核。我们以往的研究主要集中在Ndrg2是一个抑制癌候选基因。NDRG2作为NDRG家族成员之一，多种肿瘤中表达降低，同时提高Ndrg2的表达能抑制肿瘤生长。是与细胞生长发育和分化增殖调控相关的重要基因细胞增殖分化相关的基因。神经发生同样也经历了神经上皮细胞增殖，细胞迁移，神经细胞分化。我们会提出Ndrg2是否对神经发生具有一定的作用。NDRG家族同源性很高，有研究表明NDRG1是脑发育相关基因，我们推测NDRG2是否也与脑发育相关。
　　近年来研究表明在胚胎早期神经管神经上皮中存在大量能够增值分化的多潜能的神经前体细胞即神经干细胞。神经干细胞增殖、存活和分化的过程称为神经发生[1]。多种动物成体脑组织中存在着进行性的神经发生，可产生新的神经元和神经胶质细胞[2]。哺乳动物中枢神经系统神经干细胞比较集中的一个重要区域是室管膜前下区(anteriorsubventricularzone,SVZa)。成年大鼠中枢神经系统的神经发生持续存在于前脑的两个区域：海马齿状回的亚颗粒层(subgranularzone，SGZ)和脑室下区(subventricularzone，SVZ)[3,4]。SVZa来源的NSCs不仅具备所有神经干细胞的共性，而且此处神经干细胞产生后，将沿着一条特定的迁移通道-喙侧迁移流(rostralmigratorystream,RMS)[5]朝嗅脑(球)迁移，在迁移过程中始终保持增殖状态和神经元前体细胞的特征而不进一步分化，到达其迁移终点后才进一步分化为成熟的神经元，成为嗅脑球中间神经元终生更新的来源，这也是SVZa神经干细胞有别于其他来源神经干细胞的主要特征。已经有报道Ndrg2在胚胎及出生后许多组织有较高的表达，在脑组织表达较高。但是就胚胎和出生后脑组织Ndrg2的分布表达模式及功能还不清楚。
　　我们用脑切片的原位杂交技术(ISH)结合免疫组织化学(ICH)[6],研究Ndrg2在胚胎发育期和出生后Ndrg2在神经发生区的表达情况。选定并观察了Ndrg2在脑发育中的表达变化规律，探讨Ndrg2在正常神经上皮细胞发育及神经管发育过程中的作用，进一步探讨Ndrg2在胚胎神经系统发生和发育过程中的作用。
　　方法：采用地高辛配基标记的Ndrg2探针，就胚胎10.5d，11.5d，12.5d,14.5d，16.5d，18.5d,P0，P7，P14，adult进行RNA原位杂交[7]，通过检测胚胎组织中mRNA的存在状况来观察基因的表达。我们利用Ndrg2在侧脑室VZ、SVZ、吻侧迁移流RMS、海马的SGZ区的表达结合免疫荧光染色BrdU，Ki67，Nestin，DCX,GFAP进行双标。结合激光共聚焦显微镜观察、图像分析及统计学分析等手段,观察在发育不同阶段的大鼠脑内Ndrg2的表达情况及SVZa神经干细胞喙侧迁移流通路上Ndrg2的分布表达情况。
　　实验结果：
　　一、Ndrg2在小鼠胚胎脑发育中的空间定位
　　1．E10.5d后小鼠胚胎各个器官组织形成分化原基，细胞快速增殖，即出现Ndrg2中枢神经系统最初的三个脑泡以及分化后的端脑、间脑、后脑均有所表达，并在相应的细胞增殖部位富集，且主要分布于室管膜区VZ。提示Ndrg2可能参与了神经管的关闭，并在神经胚形成发挥功能作用。
　　2.神经细胞的发生和大脑皮质正常结构的形成是通过细胞迁移，使得最初构成神经管壁全部的单层神经管上皮细胞分化出皮质六层结构的过程。在这一过程中，我们观察到NDRG2的表达在胚胎发育的早期就出现在室管膜层的神经管上皮细胞内，继而随着上述的迁移过程，相继表达于边缘层，Ndrg2在皮层的表达出现动态变化。为进一步观察NDRG2在侧脑室VZ的动态表达。我们主要观察大脑皮层的发育。在10.5天，Ndrg2在脑室层VZ有表达，在E11.5天NDRG2表达同10.5天(图3A).在E12.5天，NDRG2在VZ保持高的表达，但是在边缘层检测到低表达（图3C)。随着皮质的发育，大脑皮质的逐渐增厚，NDRG2不同的表达从深层向浅层迁移。从E14.5天到E16.5天(图D,E)在VZ，SVZ,CP检测到NDRG2强表达，在IZ，SP,MZ中度表达。在E18.5天（图3F)，在VZ,SVZ保持高表达，而在其他各层表达较低。这种表达模式在P0和P7没有改变。
　　3.为了进一步探讨Ndrg2在脑室层细胞的分布，定位。在胚胎E11.5天的脑室层，我们用Ndrg2原位杂交与免疫组化双标。图4为Ndrg2原位杂交与BrdU、Ki67、Nestin在脑室层的双标。Ndrg2为绿色伪彩，BrdU、Ki67、Nestin为红色，大约90％的BrdU、Ki67阳性细胞表达Ndrg2，我们发现大部分表达Ndrg2的细胞在VZ层同时被Nestin标记。在侧脑室的VZ层内侧，有较多的双标细胞，随着脑发育双标细胞逐渐减少。以上进一步说明在Ndrg2在VZ的神经前体细胞表达。
　　二、Ndrg2在出生后小鼠脑组织中的空间定位
　　1．采用脑切片的原位分子杂交、免疫组化技术发现脑内Ndrg2表达时空模式。在侧脑室的室管膜区（VZ），脑室下区(subventricularzone，SVZ)，海马齿状回的亚颗粒层(subgranularzone，SGZ)都表达Ndrg2较强的信号。提示Ndrg2主要参与了出生后小鼠脑组织的神经发生。
　　2．采用上述原位杂交结合免疫荧光BrdU、DCX、GFAP标记技术分析结果显示，小鼠脑组织的侧脑室，同时在脑室下区(SVZ)，齿状回的颗粒下层(SGZ)，吻侧迁移流RMS有原位杂交Ndrg2/BrdU强双标信号。在海马齿状回的颗粒下层，作为海马神经前体细胞集中的部位，增值分化为神经元，有Ndrg2/BrdU的双标细胞，同时有Ndrg2/DCX双标的神经元前体细胞，有Ndrg2/GFAP双标的胶质细胞，除了SVZ、SGZ、RMS外，在脑组织其他部位Ndrg2/GFAP双标较少。
　　三、Ndrg2在脊髓、小脑、视网膜组织中的表达
　　1．脊髓：Ndrg2在脊髓的灰质有广范的表达，同时从E11.5-E18.5在中央管的室管膜层有强表达。Ndrg2的表达主要在脊髓的腹侧有表达强的信号，背侧阳性信号较弱，在新生鼠（P0）检测Ndrg2阳性信号很弱。Ndrg2分布在E12.5脊髓的VZ的背部低表达，而在VZ的腹侧高表达。BrdU染色细胞的数量在背侧区域比腹侧明显多。在腹侧有少数细胞双标。
　　2．小脑：Ndrg2在E14.5d时，在小脑原基和第四脑室的室管膜层有表达。在出生后，小脑皮层包括四层：外层颗粒细胞层(EGL),分子层（MCL），蒲肯野细胞层(PCL)、内颗粒层(IGL)。外颗粒层分化、迁移穿过分子层、蒲肯野细胞层形成内颗粒层(GoldowitzandHamre,1998)[9]。Ndrg2在出生后7、14天（P7、P14）在蒲肯野细胞层有强的信号，同时在P14在分子层、内颗粒层可见Ndrg2表达。所以EGL是产生小脑颗粒细胞的过渡增殖层，BrdU标记在这一层，Ndrg2在出生后7、14天（P7、P14）主要在蒲肯野细胞层有强的信号。在蒲肯野细胞层仅有少数双标细胞。
　　3．视网膜：在E11.5在视网膜全层有Ndrg2强的阳性信号，随着胚胎视网膜发育，Ndrg2局限于神经节细胞层，外层表达渐弱。ONB产生视网膜各类细胞，处于增殖期，BrdU在这一层标记。在视网膜外层有少数细胞双标。
　　Ndrg2在小脑，视网膜，脊髓的表达并没有在增殖细胞层，大脑皮层中等表达，所以Ndrg2主要在有丝分裂后神经元表达。
　　结论
　　1．Ndrg2在胚胎脑组织中分布在包括端脑、间脑、后脑、海马、脊髓的室管膜区（VZ）区强表达。主要在VZ层的神经前体细胞集中。
　　2．Ndrg2在出生后脑组织的侧脑室、海马、小脑、嗅球、纹状体、丘脑表达较强的信号，并且阳性局限于侧脑室的SVZ、吻侧迁移流、海马的SGZ表达较强。
　　3．Ndrg2在出生后小脑PCL，视网膜INB有强表达，脊髓腹侧表达。在大脑皮层中等表达，这些部位是有丝分裂后神经元分化的部位。说明Ndrg2在有丝分裂后及成熟神经元有表达。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、神经干细胞的研究

二、神经发生

三、胚胎发育与肿瘤

四．NDRG2 的研究

五、NDRG2 与病理过程1、缺血性脑损伤

六、方法讨论

正文

实验一 Ndrg2 在胚胎鼠脑组织神经发生区中的表达

1 材料

2 方法

3 统计学处理：

实验二 Ndrg2 在出生小鼠脑组织神经发生区的表达

1 材料

2 实验方法

结 果

讨 论

小结

参考文献

附 图

个人简历

致谢