硫氧还蛋白硝基化在糖尿病心肌缺血/再灌注损伤中的作用及机制研究

摘要

背景：
　　糖尿病显著增加冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率及死亡率。急性心肌梗死患者即使溶栓或介入及时开通闭塞血管实现缺血心肌再灌注，即使既往无糖尿病史，只要合并存在高血糖依然可显著增加其心力衰竭和死亡的发生率。这提示糖尿病特别是高血糖可能并不完全依赖冠状动脉粥样硬化病变程度可以直接增加心肌自身对缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的敏感性，由于动物研究仍存在一定争议，因此目前尚无定论。氧化应激是糖尿病或I/R损伤的中心环节，因此氧化应激的增强及其产生的自由基对细胞内分子的影响可能是糖尿病加重心肌缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）损伤的重要原因。这些自由基可以对细胞内许多关键蛋白质进行化学修饰，进而影响基因表达、信号转导、抗氧化防御等，是氧化应激损伤细胞的重要途径。蛋白质硝基化作为其中的一种重要修饰，可以改变蛋白质的结构和功能，该修饰在几乎所有心血管疾病中均可检测到，糖尿病MI/R损伤也不例外，但具体发生硝基化的靶蛋白及作用机制均有待阐明。硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是体内重要的抗氧化分子之一，不仅具有强大的抗氧化作用，而且可以作为信号分子影响信号转导通路，已有观点认为它是维持心血管稳态的关键调节分子。值得指出的是，我们的前期研究已发现Trx具备发生硝基化修饰的特点，硝基化后活性不可逆性丧失。本研究将结合在体及离体实验探讨Trx硝基化在糖尿病MI/R损伤中的作用及其机制。
　　目的：
　　1.探讨高糖条件下心肌细胞是否对I/R损伤的敏感性增加；
　　2.明确蛋白质硝基化在糖尿病MI/R损伤中的作用；
　　3.阐明Trx硝基化在糖尿病MI/R损伤中的作用及机制；
　　方法：
　　1.利用链脲菌素（streptozocin，STZ）低剂量每天注射一次，连续注射5d的方法诱导糖尿病小鼠模型，血糖仪检测血糖，继续观察5d后用于后续实验；
　　2.结扎小鼠冠状动脉左前降支制备MI/R模型，给予30min缺血处理，再灌前分别给予生理盐水对照、EUK134（硝基化自由基清除剂）或外源性Trx干预；
　　3.再灌3h后利用TUNEL染色及Caspase-3活性检测细胞凋亡；利用试剂盒检测p38MAPK活性；利用免疫组化染色及ELISA试剂盒检测硝基酪氨酸含量反映蛋白质硝基化程度；利用胰岛素还原法检测Trx活性；利用免疫共沉淀检测Trx硝基化、Trx与凋亡调节激酶1（apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1）间相互作用；
　　4.再灌24h后利用心脏超声检测左室射血分数；利用血流动力学检测室内压最大变化速率、左心室舒张末压；心功能检测完毕后重新结扎前降支利用Evans蓝/TTC染色测量心肌梗死面积；
　　5.Langendorff灌注胶原酶消化分离成年小鼠心肌细胞，给予正常或高糖培养基培养12h，利用WesternBlot检测诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitricoxideSynthase，iNOS）和NADPH氧化酶核心蛋白gp91phox的表达；进而给予3h缺氧处理（低氧孵箱无糖培养），缺氧结束后即刻给予PBS对照、1400W（iNOS抑制剂）、Apocynin（NADPH氧化酶抑制剂）或外源性Trx干预；
　　6.给予复氧3h后利用Caspase-3活性检测心肌细胞凋亡；利用胰岛素还原法检测Trx活性；利用免疫共沉淀检测Trx硝基化；
　　结果：
　　1.完成STZ最后一次注射后第5d，STZ组小鼠血糖范围在20.8±1.5mmol/L，显著高于对照组7.5±1.3mmol/L，并高于小鼠正常血糖水平10mmol/L；
　　2.相比于正常血糖对照组，再灌注3h后，糖尿病组心肌组织TUNEL阳性细胞比例及Caspase-3活性进一步增高，表明凋亡增加；硝基酪氨酸含量及Trx硝基化失活进一步增多，Trx与ASK1蛋白间的结合减少，p38MAPK活性进一步升高；再灌注24h后，心肌梗死面积进一步扩大，左室射血分数、室内压最大变化速率进一步减低，左心室舒张末压进一步升高；
　　3.再灌前给予糖尿病组EUK134可以明显减少MI/R后心肌组织硝基酪氨酸含量；抑制Trx的硝基化失活；增强Trx与ASK1蛋白间的结合，抑制p38MAPK活性；给予EUK134或外源性Trx可以明显降低心肌组织的TUNEL阳性细胞比例及Caspase-3活性，减少细胞凋亡；减小心肌梗死面积；增加左室射血分数及室内压最大变化速率，降低左心室舒张末压；
　　4.所分离的成年小鼠心肌细胞在镜下呈长杆状，能看到明显的横纹，无频繁的自发性收缩，Trypan蓝染色细胞存活率>80％；
　　5.高糖培养12h使心肌细胞内iNOS、gp91phox表达增加，进而给予缺氧/复氧损伤，相比于普通培养基组，高糖组心肌细胞Caspase-3活性进一步增高，表明凋亡增加，硝基酪氨酸含量和Trx的硝基化失活进一步增加；
　　6.复氧时给予高糖培养组1400W、Apocynin可以明显减少心肌细胞内硝基酪氨酸含量；抑制Trx的硝基化失活；给予1400W、Apocynin或是外源性Trx可以明显降低Caspase-3活性，减少心肌细胞凋亡。
　　结论：
　　1.高糖条件下心肌细胞自身对I/R的损伤敏感性增加，心肌细胞凋亡增多导致心肌损伤加重，表现为MI/R后的心肌梗死面积增大以及心功能的进一步恶化；
　　2.糖尿病条件下MI/R引起的蛋白质硝基化进一步增加是引起心肌细胞凋亡及心肌损伤加重的直接原因；心肌细胞内iNOS及gp91phox的表达增加在导致心肌细胞蛋白质硝基化增加及细胞凋亡方面发挥了一定作用；
　　3.糖尿病条件下MI/R引起的心肌细胞Trx硝基化失活进一步增加，Trx与ASK1解离，激活ASK1-p38MAPK信号通路是心肌易损性增加、凋亡增多的内在分子机制。

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声明

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缩略语表

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英文摘要

前言

研究背景

一、糖尿病与冠心病的关系

二、MI/R 损伤概述

三、氧化应激在 MI/R 损伤中的作用

四、细胞凋亡在 MI/R 损伤中的作用

五、以 ROS 为核心的高血糖损伤机制

六、蛋白质硝基化

七、心肌细胞内的抗氧化系统

八、Trx

正文

第一部分 糖尿病对 MI/R 损伤的影响

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分 蛋白质硝基化在糖尿病MI/R 损伤中的作用

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第三部分 Trx 硝基化在糖尿病 MI/R 损伤中的作用

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢