电离辐射诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化及TGF-β在此过程中的作用

摘要

放射治疗是目前肿瘤治疗的重要手段之一，但治疗后肿瘤转移灶的形成却严重影响着放疗的效果。放疗是否能够直接导致肿瘤细胞发生转移目前尚无定论，因此针对肿瘤转移的某个关键环节作为靶点探讨电离辐射（ionizingradiation,IR）与肿瘤转移的关系及相关机制，将为理解放疗后肿瘤转移的机制、优化临床放疗策略提供新的思路。
　　研究表明，上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是肿瘤转移的重要机制之一。在一些细胞因子、生长因子等细胞外信号的刺激下，肿瘤细胞可以通过EMT获得迁移和侵袭能力，进而形成远位转移灶。其中，转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-beta,TGF-β）是肿瘤细胞发生EMT的重要诱导因子之一。值得注意的是，相关临床和实验研究结果显示，IR可以诱导肿瘤细胞及其周围组织TGF-β的活化，进而引起放射性炎症、纤维化、甚至肿瘤的转移和复发。因此，观察IR与EMT发生的相关性，以及TGF-β在其中所发挥的作用，将为明确IR和肿瘤转移的关系提供重要的实验证据。
　　本研究以来源于三种组织、分别具有不同转移潜能的六种肿瘤细胞系为研究对象，通过形态学、EMT标志物和功能学指标研究了IR对EMT的影响，并围绕TGF-β表达水平的变化，通过特异性通路抑制剂的应用，进一步明确了TGF-β及其下游信号通路在IR诱导肿瘤细胞EMT中的作用。
　　方法：
　　1、选用人结直肠癌细胞SW480和SW620、人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、人肺癌细胞A549和PC14六种肿瘤细胞为研究对象，对其进行2Gy60钴（60Co）γ射线照射，通过显微镜观察、免疫印迹和免疫荧光、细胞划痕试验以及Transwell侵袭实验检测其形态学、EMT标志物、迁移和侵袭能力的变化，评价IR与EMT的相关性。
　　2、利用酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）观察2Gyγ射线照射后上述六种肿瘤细胞TGF-β表达水平的改变。
　　3、采用免疫印迹法研究IR对A549细胞p-Smad2/3表达的影响，通过给与ALK-5特异性抑制剂SB431542，观察TGF-β/Smad信号在IR诱导EMT中的作用。
　　4、A549细胞经2Gyγ射线诱导一次后，利用克隆形成实验检测其放射抗性。
　　5、2Gyγ射线照射后，检测A549细胞p-Akt的表达，通过给与PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002，观察Akt在IR诱导EMT中的作用；联合应用SB431542和LY294002，探讨TGF-β和Akt的关系。
　　结果：
　　1、经2Gyγ射线照射后，六种肿瘤细胞均呈现出间质细胞样外观，与对照组相比，上皮标志物E-Cadherin和Cytokeratin表达降低，间质标志物N-Cadherin和Vimentin表达增高，划痕伤口愈合面积增大，Transwell小室穿膜细胞增多，提示本实验条件下的IR能够促进肿瘤细胞EMT的发生。
　　2、六种肿瘤细胞经2Gyγ射线照射后，TGF-β的表达水平明显升高。
　　3、2Gyγ射线照射后的A549细胞p-Smad2/3的表达明显升高；应用TGF-β/Smad通路的抑制剂SB431542处理后，p-Smad2/3的水平降低，同时上皮标志物E-Cadherin表达升高，间质标志物N-Cadherin表达降低，划痕伤口愈合面积及Transwell穿膜细胞也明显减少。结果提示TGF-β/Smad信号在IR诱导肿瘤细胞的EMT中发挥一定的作用。
　　4、经2Gyγ射线诱导一次后的A549细胞再次接受γ射线照射，其存活率明显增高，表明A549细胞的放射抗性增加。
　　5、2Gyγ射线照射后的A549细胞p-Akt的表达明显升高；应用PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002处理后，p-Akt的水平降低，同时上皮标志物E-Cadherin表达升高，间质标志物N-Cadherin表达降低，划痕伤口愈合面积及Transwell穿膜细胞也明显减少。结果提示Akt信号在IR诱导肿瘤细胞的EMT中发挥一定的作用。进一步研究结果显示，当给与SB431542时，受照的A549细胞P-Smad2/3和p-Akt的表达均降低，而当给与LY294002时，p-Akt表达减少，而p-Smad2/3则呈增加趋势。提示：在IR促进肿瘤细胞发生EMT的过程中，TGF-β也可通过激活Akt通路发挥作用。
　　结论：
　　IR能够促进离体肿瘤细胞EMT的发生，TGF-β诱导的Smad通路和Akt通路在其中均扮演着重要的角色。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal ransition, EMT）

一、EMT 的定义

三、EMT 的分类

四、EMT 与肿瘤演进和转移

五、前景和展望

TGF-β 信号及其在肿瘤生物学的作用

一、TGF-β 的结构

二、TGF-β 信号

三、TGF-β 信号及其在肿瘤生物学的作用

四、电离辐射（ionizing radiation, IR）对 TGF-β 及其相关信号的作用（图7）

五、TGF-β 的应用前景及未来研究的方向

正文

实验一 电离辐射诱导离体肿瘤细胞发生EMT

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 TGF-β在电离辐射诱导肿瘤细胞EMT发生中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢