次声抑制海马神经发生相关机制的研究

摘要

物体机械振动而产生的频率小于20Hz的声波被称为次声，广泛存在于自然界及社会环境中。次声具有频率低、穿透性强、远距离传播过程中衰减小等特性，很难做到有效防护，因此高强度次声对生物体的影响巨大。次声的来源非常广泛，是噪音污染的重要组成部分。次声对机体多个系统均可产生不良影响。由于脑的固有频率恰处次声作用范围，是其损伤最为严重的部位。次声引起的脑损害中，学习记忆功能的下降最为突出。
　　由于学习记忆能力与海马密切相关，而海马功能的发挥源于其内部终生自我更新的NSCs，这群细胞在海马增殖、迁移、分化为成熟神经元并整合到神经网路中，参与学习记忆的调节。近年来研究已经证实，次声作用后，海马齿状回NSCs数量显著减少。然而，次声发挥抑制作用的机制却尚未阐明。
　　海马神经发生的调节是个复杂的过程，有赖于NSCs内外双方面因素的共同调控。脑内小胶质细胞和星形胶质细胞介导的炎性反应是引起NSCs增殖减少的一个重要的细胞外因素。而且有研究表明，次声作用后两种胶质细胞均有显著激活，数量增多。那么，激活的胶质细胞是否可以引起NSCs数量的减少呢？另外，细胞内机制也是调控神经发生的重要因素，次声有可能对NSCs发挥直接的损伤作用。
　　目的：
　　（1）明确小胶质细胞和星形胶质细胞在次声引起的神经发生减少过程中所发挥的作用及相关作用机制。（2）观察次声对体外培养的NSCs存活、增殖和分化的影响。
　　方法：
　　（1）成年大鼠经16Hz、130dB次声作用7d后，观察其海马齿状回NSCs增殖、迁移和分化的变化。（2）分别采用小胶质细胞和星形胶质细胞的特异性抑制剂米诺环素及氟代柠檬酸阻断两种细胞的激活，观察次声后大鼠海马齿状回NSCs数量的改变。（3）体外分别培养两种胶质细胞，经过次声作用后，于不同时间点将其上清液加入离体培养的NSCs中，观察NSCs存活和增殖的变化。（4）通过应用液相蛋白芯片技术检测次声后成年大鼠海马组织多种细胞因子表达水平的变化，及观察次声作用后离体培养小胶质细胞和星形胶质细胞炎性通路NF-κB的改变，探讨次声引起神经发生减少的相关炎性机制。（5）体外培养NSCs，观察次声对其存活、增殖和分化的影响。
　　结果：
　　（1）次声作用可显著减少海马齿状回NSCs及新生神经元的数量，但对NSCs的迁移和分化并无明显作用。（2）大鼠次声暴露后分别应用米诺环素和氟代柠檬酸干预，其NSCs数量及新生神经元数量较单纯次声暴露组显著增多。（3）NSCs的MTT检测及BrdU和Ki67免疫细胞化学染色结果表明，次声暴露后8h、12h及24h小胶质细胞和星形胶质细胞的上清液均可明显抑制NSCs的存活和增殖。（4）液相蛋白芯片检测结果表明，次声后大鼠海马组织IL-1β的含量较对照组显著升高。Westernblot结果显示，次声后小胶质细胞和星形胶质细胞NF-κbp65的表达均显著升高。（5）次声作用后神经球计数结果提示神经球的数量显著减少、直径明显减小。MTT检测和免疫荧光染色结果提示，NSCs的存活率和数量与对照组相比均显著下降。另外，Tuj1、GFAP和CNPase免疫荧光染色结果表明，次声后NSCs分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的比例均未发生明显变化。
　　结论：
　　次声作用可通过细胞内外两方面因素共同抑制NSCs的增殖。其中，次声后的炎性反应在细胞外因素中发挥重要作用，可通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞，调控NF-κb通路，引起炎性因子IL-1β的释放增多，来实现次声对神经发生的抑制作用。另外，次声也可以通过细胞内途径直接损伤NSCs，抑制其增殖和存活。

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缩略语表

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前言

文献回顾

第一部分 次声对中枢神经系统作用的研究进展

1 次声的物理学特性和声源

2 次声的作用机制

3 次声对脑的影响

4 胶质细胞对次声的反应

第二部分 成年海马神经发生相关研究进展

1 海马 NSCs 的产生和分型

2 新生神经元的迁移、存活、成熟和整合

3 海马神经发生在学习和记忆过程中的作用

4 神经发生微环境对神经干细胞的影响

5 海马齿状回神经发生的调节

第三部分 炎性反应对成年神经发生的影响

1 中枢神经系统疾病和损伤中的炎性反应

2 炎性反应与成年动物神经发生

3 NF-κB 通路在炎性反应中的作用及其对神经发生的调节

正文

第一部分 次声对成年大鼠海马齿状回神经干细胞增殖、迁移和分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 米诺环素和氟代柠檬酸对次声后成年大鼠海马齿状回神经发生的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 次声作用后小胶质细胞和星形胶质细胞上清液对离体培养神经干细胞的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 小胶质细胞和星形胶质细胞引起次声后神经发生减少作用机制的探讨

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五部分 次声对体外培养神经干细胞存活、增殖和分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢