丘脑底核神经元的共振及其和多巴胺受体的关系

摘要

研究背景：
　　大脑是一个高度分布式系统，不同感知信息在大脑的不同脑区得到处理和并行执行，但并没有一个统一的协调中心负责管理不同脑区功能的协调。大脑的“同步振荡”活动被认为是“捆绑”一些空间上分隔，但又彼此相关的神经信息的机制之一，可协助大脑实现多脑区的协同工作。目前普遍认为神经元共振是神经网络振荡活动的重要基础。现已发现皮层和海马等部位神经元均存在共振现象，并证实这些细胞的共振参与了振荡节律的形成，具有重要生理功能。但对基底节（BG）各核团神经元共振特性的研究还处于空白状态，研究BG各核团神经元的共振及其机制，有可能帮助我们深入认识BG系统调节运动功能的电生理机制。
　　帕金森病（PD）等病理条件下，BG的异常同步振荡可通过神经投射通路影响大脑皮层，导致皮层感觉运动区活动异常，从而错误地“捆绑”了多脑区的运动信息，造成本该协同工作的肌肉群发生紊乱，导致相应的临床症状。目前，BG-皮层环路的异常同步振荡已成为PD的新病理机制，但发生异常振荡的机理仍不清。神经元共振是神经网络振荡活动的重要基础，故研究BG各核团神经元的共振现象及其和PD的关系意义重大，有可能在PD发生的电生理机制方面有所突破。
　　丘脑底核（STN）在PD的形成发展过程中起了重要作用，是临床DBS治疗PD的主要靶核之一。目前已证实黑质致密部和STN间存在直接的多巴胺能纤维联系，多巴胺可通过STN神经元表面的多巴胺受体直接作用于其神经元。故本课题首先选取STN作为研究对象，研究其共振现象及机制，并深入研究该神经元共振和多巴胺受体的关系。
　　实验目的：
　　（1）研究STN神经元是否有共振现象并研究其常规特性；
　　（2）探索STN神经元共振的离子机制；
　　（3）分别研究多巴胺D1、D2受体阻断剂对STN神经元共振特性的影响及其和超极化激活的阳离子流（Ih）的关系；
　　（4）初步探索多巴胺受体阻断剂影响STN神经元共振的信号转导途径。
　　实验方法：
　　（1）脑片准备及钳制细胞
　　异氟烷吸入麻醉后断头处死大鼠（13-18天，雄性），迅速取脑，置于予充混合氧（95％O2，5％CO2）的冰浴人工脑脊液（ACSF）中，振动切片机切取含STN的脑片（350-400μm），在ACSF中孵育（34℃）1小时，以恢复脑片状态，将脑片移至记录浴槽，用氧饱和的ACSF持续灌流(2ml/min)。开启浴槽加热系统，使脑片温度维持在34℃。镜下定位核团并选取活性较好的细胞，常规钳制细胞形成全细胞模式，所用玻璃微电极电阻3-7MΩ。让细胞恢复约5分钟后，利用细胞的电生理特征鉴定细胞并测试细胞膜电位、动作电位等常规参数，选择串联电阻在10-20MΩ，静息电位负于-55mV，同时动作电位超射较好的神经元进行实验。
　　（2）神经元共振特性测试
　　在全细胞电流钳模式下，先用直流电将细胞钳制于目标电压（-50mV，-60mV，-70mV，-80mV及-90mV），通过记录电极给予细胞一个振幅固定、频率随时间线性增大的正弦电流（ZAP）刺激，记录神经元的电压反应。共振表现为神经元膜电压在某个特定的频段出现一个可重复的凸起——共振峰，共振峰所对应的频率即为细胞的共振频率(fres)。为了量化共振的强度，将共振峰的阻抗值与0.5Hz对应的阻抗值的比值作为衡量共振强度的指标，称为Q值。调整ZAP电流强度使其引起的电压反应峰—峰值控制在±10mV以内，以免诱发动作电位，必要时可适当使用河豚毒素（TTX）。为了方便测量fres及Q值，将记录到的电压反应和输入的ZAP电流进行快速傅立叶变换(FFT)，计算阻抗值(Z)，公式为：Z=FFT(V)/FFT(I)，绘制阻抗曲线，在阻抗曲线上很容易读出fres并计算出Q值。为了排除刺激的时间依赖性对细胞共振峰的影响，给予反向ZAP电流（时程20s，频率18-0Hz）刺激，观察细胞的电压反应与正常ZAP刺激结果是否一致。
　　（3）神经元放电的频率选择性测试
　　在全细胞电流钳模式下，先用直流电将细胞钳制于目标电压（-70mV），通过调节增益水平逐渐加大ZAP电流的幅度，直至刚刚出现动作电位，观察细胞放电所对应的频段。为了排除放电的时间及波形依赖性，换一种刺激方式，给予不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，同法观察细胞的优先放电频率。
　　（4）神经元Ih的记录
　　钳制细胞形成全细胞模式并待细胞状态稳定后，在全细胞电压钳模式下，给予一串超极化step电压刺激，记录膜电流，Ih表现为一缓慢激活的内向电流。
　　（5）Ih在STN神经元阈下共振及放电频率选择性中的作用
　　在外液中给予Ih特异性阻断剂ZD7288(20μM)，观察给药前后STN神经元阈下共振及放电频率选择性的变化。
　　（6）不同多巴胺受体阻断剂对STN神经元共振的影响
　　①分别给予氯氮平（Clozapine，50μM）、氟哌啶醇（Haloperidol，30μM）、SCH-23390(1μM)、舒必利（Sulpiride，1μM）等不同亚型多巴胺受体的阻断剂，观察给药前后STN神经元共振特性的变化，研究其对STN神经元共振特性的影响。
　　②前面实验证实D2受体特异性阻断剂Sulpiride可阻断STN神经元的共振现象，但D1受体特异性阻断剂SCH-23390对共振无显著影响。故我们进一步研究Sulpiride对Ih的影响，探索其影响共振的离子机制，并研究其对STN神经元放电频率选择性的影响。
　　（7）Sulpiride影响STN神经元的信号转导途径初探
　　①按下表分组、加药（n=10）
　　②主要观察指标有：神经元阈下共振特性、神经元放电的频率选择性。钳制细胞形成全细胞模式后等20min左右，待GDP-β-S、GTP-γ-S、GTP等药物扩散至细胞内、有效作用于细胞后再开始实验，方法同前。
　　（8）所记录神经元的定位及形态学观察
　　随机抽取部分神经元(15个)行荧光黄标记染色，用含荧光黄的电极内液(1.5‰)在避光条件下钳制细胞，常规行电生理记录，留置电极30min以上，荧光光源下观察神经元形态，确认染色充分后，缓慢退出电极。将脑片切掉一角并记录，以标记正反面，在4％多聚甲醛中避光固定。将甲醛固定过的脑片铺于载玻片上，有标记细胞的一面朝上，荧光封片液、指甲油封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
　　（9）统计学处理
　　采用SPSS13.0进行分析，实验结果用均值±标准差（x±SD）表示。各组间的数据用One-wayANOVA或Two-wayANOVA进行比较，两两之间用LSD方法进行比较，两组间均数的比较采用t检验，如P<0.05则认为有统计学差异。
　　实验结果：
　　（1）STN神经元的形态学定位及电生理鉴定
　　激光共聚焦显微镜下观察荧光黄标记的STN神经元，低倍镜下证实实验所选细胞均位于STN，高倍镜下可见神经元胞体、轴突清晰可见，形态符合STN神经元特征。电压钳下给予一串超极化Step电压刺激，可见明显Ih及尾电流。电流钳下给予一串外向电流刺激，使细胞超极化，记录细胞的电压反应，其主要特征有刺激起始段的“Sag”、刺激末伴随动作电位的反跳去极化及动作电位后的平台电位，符合STN神经元的电生理特性。
　　（2）STN神经元的阈下膜共振
　　在34℃条件下，将细胞钳制于-70mV水平，给予ZAP电流刺激，记录到的电压反应呈梭形，在2.5-3Hz频段，电压反应显著增强，证实细胞存在共振现象。将数据做快速傅立叶变换，绘制阻抗曲线，可见该细胞fres亦在2.5-3Hz频段。统计分析示神经元共振的fres和Q值分别为2.67±0.29Hz和1.093±0.0202(n=8)。反向ZAP电流刺激产生的电压反应较上述结果无明显差异(P>0.05,n=6)。
　　（3）STN神经元共振的温度依赖性
　　将细胞钳制于-70mV水平，在30℃、34℃、38℃三个不同温度水平观察STN神经元的共振特性。神经元fres随温度升高而升高，统计数据示：神经元fres在30℃、34℃、38℃条件下分别为1.99±0.36Hz、2.67±0.29Hz、4.07±0.40Hz，经单因素方差分析统计三组间统计学差异显著(P<0.05，n=8)。
　　（4）STN神经元共振的电压依赖性
　　在-60mV到-90mV水平神经元对ZAP电流的电压反应呈梭形，共振明显。fres随电压的超极化而升高，可从-60mV时的2.01±0.25Hz升高到-90mV时的3.09±0.32Hz，经方差分析统计各组间统计学差异显著(P<0.05，n=10)。Q值亦有显著电压依赖性，-60mV、-90mV时其水平较低，-70mV条件下Q值最大，达1.092±0.021。-50mV条件下神经元对ZAP电流的电压反应呈喇叭口状，无明显共振现象。
　　（5）STN神经元放电的频率选择性
　　给予ZAP电流证实STN神经元存在阈下共振后，逐渐加大ZAP电流的幅度，直至刚刚出现动作电位，发现细胞最先出现放电的频段和其fres一致。换一种刺激方式，给予不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，结果亦证实细胞最先出现放电的频段与fres一致。
　　（6）抑制Ih可阻断STN神经元的阈下共振及其放电频率选择性
　　在全细胞电压钳模式下，Ih表现为一缓慢激活的内向电流，在各电位水平均可被ZD7288显著抑制（P<0.05，n=12）。生理条件下神经元存在共振现象，放电的频率选择性明显，给予ZD7288阻断Ih后，记录的电压反应变为喇叭口状，共振消失、神经元放电的频率选择性也同时消失。统计分析显示ZD7288消除共振及放电频率选择性的有效率均可达100％(n=10)。
　　（7）多巴胺受体阻断剂对STN神经元阈下共振的影响
　　外液中加入Clozapine(50μM)或Haloperidol(30μM)同时阻断D1、D2受体后，神经元对ZAP的电压反应呈喇叭口状，共振现象被消除。外液中加入Sulpiride单纯阻断D2受体效果类似。统计分析显示Clozapine、Haloperidol及Sulpiride消除共振的有效率均可达100％(n=10)。外液中加入SCH-23390单纯阻断D1受体，STN神经元阈下共振未见明显改变（P>0.05，n=10）。
　　（8）Sulpiride对STN神经元放电频率选择性的影响
　　在34℃、-70mV条件下，给药前，细胞最先出现放电的频段与细胞的fres一致。外液中加入Sulpiride(1μM)阻断D2受体后，细胞在最低频率处首先出现放电，与ZD7288的效果类似。更换刺激方式为不同频率的等幅恒频的正弦电流刺激，结果类似。上述两种方法均证实Sulpiride阻断STN神经元放电频率选择性的有效率达100％(n=10)。

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缩略语表

中文摘要

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前 言

文献回顾

1. 帕金森病研究现状

2、神经系统的同步振荡理论

3、BG-皮层环路的异常同步振荡已成为 PD 的新病理机制。

4、神经元的共振现象

5、基底节、丘脑底核

6、Ih 的功能及其和 PD 的关系

正 文

第一部分 丘脑底核神经元的共振现象及其离子机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 丘脑底核神经元共振和多巴胺受体的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢