尼古丁影响人牙周膜细胞IL-1β、IL-6表达及诱导Th17分化的体外研究

摘要

牙周炎是一种危害人体口腔健康的常见和高发病，可造成牙周支持组织的进行性破坏。吸烟作为牙周炎的高危因素，与牙周炎的发生发展密切相关，但其机制尚不明确。尼古丁作为烟草中的主要毒性物质，在吸烟相关性牙周炎的发生发展中发挥着重要作用。本课题组在前期的研究中发现大鼠的牙周组织和体外培养的人牙周膜细胞中存在尼古丁的特异性受体—烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)的表达，尼古丁可明显上调该受体的表达，加重牙周组织炎症。提示尼古丁可能通过与α7nAChR结合后产生一系列生物学效应，进而影响疾病的进程，但其机制尚不完全明了。
　　目前研究认为免疫反应最终决定了牙周炎的发展方向。最近发现的一种可以特异性分泌IL-17的Th17细胞，凭借强大的促炎和骨破坏作用影响牙周炎的转归和预后。而尼古丁与α7nAChR特异性结合后，是否能通过诱导Th17细胞分化生成，引起免疫炎症反应进而影响吸烟相关性牙周炎的进程？目前尚未见相关报道。
　　本研究以体外培养的人牙周膜细胞、外周血CD4+T细胞以及人牙周膜细胞和外周血CD4+T细胞共培养体系为实验模型，观察尼古丁作用后人牙周膜细胞IL-1β、IL-6的变化，并进一步探讨IL-1β、IL-6能否诱导CD4+T细胞向Th17分化，以期阐明尼古丁和α7nAChR在吸烟相关性牙周炎中的作用机制。
　　第一部分人牙周膜细胞的体外培养及鉴定
　　主要方法：取12～15岁正常人因正畸治疗拔除的健康无龋第一前磨牙，无菌条件下刮取根中1/3牙周膜组织，组织块法行人牙周膜细胞原代培养。常规传代，取第五代细胞进行免疫组化染色，观察角蛋白、波形丝蛋白表达，鉴定细胞来源。
　　主要结果：原代培养9天后组织块周围爬出呈长梭形的成纤维样细胞，常规传代后，镜下见细胞密度均匀，铺满瓶底，呈放射状排列；细胞呈长梭形，细胞浆均匀丰满，核仁圆形且清晰。免疫组化结果显示体外培养的人牙周膜细胞角蛋白染色阴性，波形丝蛋白染色阳性，证实其细胞来源为间充质。
　　主要结论：成功建立实验模型。所培养细胞来源于间充质，系人牙周膜细胞。
　　第二部分尼古丁对体外培养的人牙周膜细胞IL-1β、IL-6mRNA表达的影响
　　主要方法：以体外培养的人牙周膜细胞为实验模型，通过PCR凝胶电泳实验和实时定量PCR检测α7nAChR激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M）作用下人牙周膜细胞IL-1β、IL-6mRNA的表达。
　　主要结果：PCR凝胶电泳结果显示在目的条带处获得单一清晰条带，相比于对照组，尼古丁组人牙周膜细胞IL-1β、IL-6mRNA表达明显升高，其余各组无明显变化；实时定量PCR显示与对照组相比，尼古丁组IL-1β、IL-6mRNA表达明显上调，具有统计学意义（P<0.05），其余各组结果与对照组相近，无统计学意义（P>0.05）。
　　主要结论：尼古丁和α7nAChR结合后，可明显上调体外培养的人牙周膜细胞合成的炎性因子IL-1β、IL-6mRNA的表达。提示尼古丁可能通过α7nAChR上调人牙周膜细胞IL-1β、IL-6mRNA的表达而对牙周组织产生影响。
　　第三部分尼古丁对体外培养的人牙周膜细胞、外周血CD4+T细胞IL-1β、IL-6蛋白表达的影响
　　主要方法：组织块法体外培养人牙周膜细胞；密度梯度离心法和流式细胞仪分选及体外培养人外周血CD4+T细胞；利用Transwell小室构建人牙周膜细胞与外周血CD4+T细胞体外共培养体系，建立三组实验模型。通过ELISA检测α7nAChR激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M）作用下人牙周膜细胞、细胞共培养体系和CD4+T细胞IL-1β、IL-6蛋白的表达。
　　主要结果：在人牙周膜细胞和细胞共培养体系中，与对照组相比，尼古丁组IL-1β、IL-6蛋白表达明显上调，具有统计学意义（P<0.05），其余各组与对照组相近，无统计学意义（P>0.05）；CD4+T细胞IL-1β、IL-6蛋白几乎无表达，各组间差异无统计学意义（P>0.05）；尼古丁（10-5M）对三组实验模型作用的结果显示，人牙周膜细胞和细胞共培养体系IL-1β、IL-6蛋白的表达基本相近，无统计学差异（P>0.05），但远远高于CD4+T细胞，差异有统计学意义（P<0.001）。
　　主要结论：共培养体系中IL-1β、IL-6蛋白是由人牙周膜细胞分泌的，CD4+T细胞几乎无IL-1β、IL-6蛋白表达且对人牙周膜细胞IL-1β、IL-6蛋白表达没有影响；尼古丁和α7nAChR结合后，可明显上调体外培养的人牙周膜细胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-6蛋白的表达，从蛋白水平验证了第二部分实验结果。提示尼古丁可能通过α7nAChR促进人牙周膜细胞分泌IL-1β、IL-6而对牙周组织产生影响。
　　第四部分尼古丁诱导人外周血CD4+T细胞向Th17细胞亚群分化的体外研究
　　主要方法：密度梯度离心法和流式细胞仪分选及体外培养人外周血CD4+T细胞；利用Transwell小室构建人牙周膜细胞与外周血CD4+T细胞体外共培养体系，建立两组实验模型。通过PCR凝胶电泳实验和ELISA检测α7nAChR激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M）作用下细胞共培养体系和CD4+T细胞IL-17的表达。
　　主要结果：PCR凝胶电泳结果显示无目的条带出现，各实验组均无IL-17mRNA表达；ELISA结果显示各实验组均无IL-17蛋白表达。
　　主要结论：本实验条件下，尚不能证明尼古丁激活α7nAChR后刺激人牙周膜细胞分泌的IL-1β、IL-6可以诱导CD4+T细胞向Th17分化。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 吸烟相关性牙周炎

2 烟碱型乙酰胆碱受体

3 Th17 细胞

正文

第一部分 人牙周膜细胞的体外培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 尼古丁对体外培养的人牙周膜细胞IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 尼古丁对体外培养的人牙周膜细胞、外周血CD4+T细胞IL-1β、IL-6 蛋白表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 尼古丁诱导人外周血CD4+T细胞向Th17 细胞亚群分化的体外研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢