丹参酮ⅡA调节电压依赖钾通道抑制大鼠慢性低氧性肺动脉高压

摘要

研究背景：
　　低氧性肺动脉高压（HPH）是指由慢性阻塞性肺病、久居高原等导致的长期缺氧所引起的以肺动脉压力持久性升高为典型特征的心肺循环功能紊乱，可诱发一系列病理生理过程，肺动脉压升高导致肺动脉主干扩张、右心负荷加重，出现右心室肥厚、扩张，严重影响心脏功能，致残率、死亡率均较高。目前尚无特效的防治手段，因此寻找有效防治该疾病的新方法、新药物已成为摆在医学科研工作者面前的一个重大课题，亟待解决。
　　丹参是一种具有悠久历史的传统中药，已被单独或联合其他药物广泛应用于临床。丹参酮是丹参中含有的一系列松香烷双萜化合物，其中以丹参酮ⅡA（TⅡA）含量最为丰富，且具有丹参的大部分功效。我课题组已证实TⅡA可有效防治慢性HPH，并初步探索了其作用机制，证实TⅡA可通过抑制PASMCs增殖、降低肺组织中内皮素1水平、抑制氧化应激水平减轻慢性HPH，但有关TⅡA防治HPH的机制仍有待深入探讨。
　　实验目的：
　　（1）证实TⅡA对慢性HPH大鼠的防治作用；
　　（2）观察TⅡA对肺动脉平滑肌细胞Kv1.5、Kv2.1表达的影响；
　　（3）探讨TⅡA对肺动脉平滑肌细胞Kv通道功能的影响；
　　（4）明确TⅡA对HPH的防治作用和Kv通道是否有关。
　　实验方法：
　　（1）动物实验：
　　实验动物、分组及模型复制
　　健康雄性成年SD大鼠，体质量200-250g。将其随机分为4组（每组8只）：正常对照组（Controlgroup）、TⅡA对照组（TⅡAgroup）、模型组（HPHgroup）及防治组（HPH/TⅡAgroup）。模型组、防治组大鼠每日置于低氧舱中低氧8h，低氧舱气压380mmHg，正常对照组、TⅡA对照组同法饲养，TⅡA对照组、防治组每日入舱前腹腔注射TⅡA(10mg/kg)，1次/日，直至实验结束（28天），正常对照组、模型组同法给予等量生理盐水。
　　观察指标
　　①经右颈外静脉及左颈总动脉测量右心室收缩压峰值（RVPSP）及平均颈总动脉压（mCAP）。处死大鼠后测量右心室肥厚指数并行肺组织HE染色，观察肺组织病理学变化并利用图像分析软件计算血管管壁面积占其总面积的百分比（MA％）及血管管壁厚度占其外径的百分比（MT％）。上述指标可客观反应慢性HPH的轻重程度，可从多角度观察TⅡA对慢性HPH大鼠的防治作用。
　　②利用Westernblotting、RT-PCR技术测定各组肺小动脉组织中Kv1.5、Kv2.1蛋白及mRNA的水平，比较各组间差异。
　　③急性分离大鼠肺小动脉平滑肌细胞（PASMCs），用全细胞膜片钳技术观察TⅡA对慢性HPH大鼠PASMCs电压依赖性钾电流（Ikv）的影响。
　　（2）血管环实验
　　实验动物同上。制备肺动脉三级分支血管环，利用生物信号采集系统记录不同条件下的血管张力。实验分为低氧组(Hypoxiagroup)、TⅡA预处理组(TⅡA+Hypoxiagroup)、TⅡA+4-氨基吡啶（4AP）预处理组(TⅡA+4AP+Hypoxiagroup)。TⅡA预处理组加苯肾上腺素(phenylephrine,PE)前给予TⅡA(10-5M)预处理20min，TⅡA+4AP预处理组加PE前给予TⅡA(10-5M)、4-AP(10-6M)预处理20min，低氧组给予等量生理盐水。预处理后先给予PE（10-6M），待其张力达到平台期并稳定后，创造低氧环境，继续记录其张力变化1h以上。
　　（3）细胞实验
　　急性分离正常大鼠PASMCs。实验分为正常对照组（Controlgroup）、TⅡA对照组（TⅡAgroup）、低氧组（Hypoxiagroup）及防治组（Hypoxia/TⅡAgroup）。对照组、TⅡA对照组浴槽中持续通入氧饱和的细胞外液，1ml/min，低氧组、防治组将所通气体换为低氧外液，TⅡA对照组、防治组细胞外液加入TⅡA，终浓度为25mg/L，对照组、模型组加入等量生理盐水。低氧1小时后利用全细胞膜片钳技术检测细胞钾电流。
　　（4）统计学分析
　　用spss软件进行统计学分析，数据以x±SE形式表示。组间比较用one-wayANOVA及leastsignificantdifferenced（LSD）进行统计学分析，以P<0.05为有显著统计学差异。
　　实验结果：
　　（1）TⅡA对慢性HPH大鼠血流动力学及右心肥厚指数的影响
　　与正常对照组相比，模型组RVPSP、RVHI均显著升高（P<0.05），TⅡA防治后上述两项指标均较模型组显著降低（P<0.05），TⅡA对照组这两项指标较正常对照组无明显改变。提示：TⅡA可降低HPH大鼠肺动脉压力并减轻其右心室肥厚程度。mCAP记录结果显示慢性低氧及TⅡA对大鼠mCAP无显著影响。
　　（2）TⅡA对慢性HPH大鼠肺小动脉组织病理学结构变化的影响
　　将肺组织HE染色后模型组大鼠镜下可见肺泡点片状出血、肺泡内可见渗出物，肺小动脉管腔明显狭窄，管壁显著增厚，以肌层增厚为主，TⅡA防治组前述病理变化较模型组显著减轻，TⅡA对照组镜下表现与正常对照组无明显差异。利用图像分析软件计算MA％及MT％发现：与正常对照组相比，模型组MA％、MT％均升高（P<0.05），TⅡA防治组MA％、MT％均较模型组显著降低（P<0.05），TⅡA对照组的MA％、MT％与正常对照组比较无明显改变。综上，TⅡA可显著减轻慢性HPH大鼠肺小动脉的组织病理学变化，减轻慢性低氧导致的肺小动脉壁增生。
　　（3）TⅡA对慢性HPH大鼠肺小动脉Kv1.5、Kv2.1蛋白表达水平的影响
　　与正常对照组相比，模型组肺小动脉Kv1.5、Kv2.1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），TⅡA防治组上述两种蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），TⅡA对照组蛋白表达水平与正常对照组无明显差异。提示：TⅡA可以显著减轻慢性低氧对肺小动脉Kv1.5、Kv2.1蛋白表达的抑制。
　　（4）TⅡA对慢性HPH大鼠肺小动脉Kv1.5、Kv2.1mRNA表达水平的影响
　　与正常对照组相比，模型组肺小动脉Kv1.5、Kv2.1mRNA表达水平均明显降低（P<0.05），TⅡA防治后上述mRNA表达水平均显著升高（P<0.05），TⅡA对照组mRNA表达水平与正常对照组无明显差异。提示：TⅡA可以显著减轻慢性低氧对肺小动脉Kv1.5、Kv2.1mRNA表达的抑制。
　　（5）TⅡA对慢性HPH大鼠PASMCs钾电流的影响
　　与正常对照组相比，模型组PASMCs钾电流密度明显降低（P<0.05），TⅡA处理后PASMCs钾电流密度较模型组显著升高（P<0.05），但仍低于正常对照组，TⅡA对照组PASMCs钾电流密度与正常对照组比较无明显差异。提示：慢性低氧可降低PASMCs钾电流密度，TⅡA可以显著减轻慢性低氧的上述作用。
　　（6）TⅡA对急性低氧性肺动脉平滑肌舒缩功能变化的影响及其可能机制
　　肺小动脉血管环被苯肾上腺素（PE）刺激后张力很快升高，并逐渐达平台期，稳定后给予低氧处理，低氧后血管环表现出双相收缩特性，第一相为一短暂的收缩期，继之血管环出现一舒张反应，称之为最大舒张反应，最后出现一长时程、逐渐增强的血管收缩反应，称为II相血管收缩。TⅡA预处理可消除低氧所致的第一相短暂收缩、增强血管环舒张反应程度、减小II相血管收缩程度并缩短其时间、使血管在II相血管收缩期后出现舒张反应，4AP可阻断除―消除第一相短暂收缩‖外的TⅡA的上述所有作用，提示TⅡA主要通过钾通道作用于血管环。
　　（7）TⅡA对急性低氧PASMCs钾电流的影响
　　与正常对照组相比，急性低氧组PASMCs钾电流密度明显降低，防治组PASMCs钾电流密度较模型组显著升高，但仍低于正常对照组，TⅡA对照组PASMCs钾电流密度与正常对照组无明显差异。提示：急性低氧可降低PASMCs钾电流密度，TⅡA可以显著减轻急性低氧的上述作用。
　　结论：
　　（1）TⅡA可显著减轻大鼠慢性HPH严重程度；
　　（2）TⅡA在mRNA、蛋白两个水平均可减轻慢性低氧导致的肺小动脉平滑肌Kv1.5、Kv2.1表达抑制；
　　（3）TⅡA可显著减轻急、慢性低氧对PASMCsIKV的抑制；
　　（4）TⅡA通过上调PASMCs的IKV水平舒张肺小动脉平滑肌。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

一、肺动脉高压的研究现状

二、肺动脉平滑肌细胞的电压依赖性钾通道

三、丹参酮ⅡA 的药理作用

正 文

实验一、TⅡA 上调 Kv 通道表达抑制慢性低氧性肺动脉高压

1 材料

2 方法

3 结果

实验二、TⅡA 活化 Kv 通道减轻急性低氧性肺动脉平滑肌收缩

1 材料

2 方法

3 结果

讨 论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢