大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒上Ⅲ型IP3受体的免疫电镜定位分析

摘要

研究背景：
　　糖尿病的发生主要是由于胰岛β细胞分泌胰岛素的绝对或相对不足而引起的。当胰岛β细胞受到内源性或外源性的物质，如葡萄糖、胰高血糖素、乳糖、核糖等刺激后，分泌胰岛素经全身血液循环运输到肌肉、肝脏和脂肪组织等靶组织和靶器官，与其相应的胰岛素受体结合后，使血糖降低的同时促进糖原、脂肪及蛋白质的合成。
　　既往研究已证明，胰岛β细胞内胰岛素分泌颗粒胞裂外排分泌胰岛素是由胞内Ca2+浓度的迅速升高而直接引起的。胞内钙库的Ca2+释放和胞膜上钙通道的Ca2+内流是胞内Ca2+升高的主要来源。胰岛β细胞中存在多种钙库[1]，如IP3（Inositol-1,4,5-triphosphate，三磷酸肌醇）敏感钙库、兰诺定（ryanodine）敏感钙库、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAADP）敏感钙库及线粒体钙库等。在小鼠胰腺细胞上首次发现了IP3敏感钙库，后来经研究证实，在神经、心肌、骨骼肌等多种细胞中都存在。IP3R（IP3Receptor）是存在于内质网及核膜上的一种配体门控Ca2+释放通道蛋白，研究发现在小鼠胰岛β细胞内胰岛素分泌颗粒上也存在IP3R[2]。分泌颗粒作为β细胞内含钙量最高的钙库，里面有大量的钙离子沉积。颗粒膜与质膜融合发生胞吐时，钙离子可伴随胰岛素内容物一起外排，从而保持质膜内外钙离子的动态平衡。而此过程可能是通过激活分泌颗粒膜上IP3R实现的。关于分泌颗粒是如何准确的参与并调节胰岛素分泌，从而控制机体生理活动的过程，目前尚不清楚，相关研究报道也甚少，并且仍有人质疑IP3R是否确实存在于分泌颗粒上[3]。因此，本研究参考并改进了Blondel[2]的实验设计，应用胶体金免疫电镜的技术对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒的IP3R-Ⅲ型进行定位分析，进一步明确分泌颗粒上IP3R-Ⅲ型的存在，提示IP3-IP3RⅢ型可能参与了β细胞胰岛素分泌的调节，为科室的进一步实验研究IP3R与胰岛素分泌的关系作出铺垫。
　　目的：
　　应用胶体金免疫电镜的技术对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒的IP3R-Ⅲ型进行定位分析，明确分泌颗粒上是否存在IP3R-Ⅲ型。为进一步揭示分泌颗粒的生理意义打下基础。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠经胰腺胆总管逆行灌注Ⅴ型胶原酶溶液充分消化后，Histopaque-1077纯化获得充盈的胰腺。
　　2.双硫腙溶液鉴定胰岛。
　　3.胰岛标本经固定后电镜制样。
　　4.免疫组织化学染色，一抗为兔抗大鼠IP3R-Ⅲ型抗体，二抗为5nm胶体金标记的山羊抗兔IgG。对照组的一抗为TBS（pH7.4），其他步骤相同。
　　5.经过醋酸铀、枸橼酸铅轻度复染后通过透射电子显微镜技术观察5nm金颗粒在胰岛β细胞的胰岛素分泌颗粒上的分布情况。
　　结果：
　　1.用双硫腙染色后的胰岛细胞团，呈圆形或椭圆形，包膜完整，界限清楚，为不透光实体。双硫腙染色后呈猩红色。每个胰岛直径约为100～300μm。
　　2.实验组的胰岛β细胞中，金颗粒大量定位于胰岛素分泌颗粒的核心及颗粒膜上。并且内质网上也有少量的胶体金标记。对照组的照片中胰岛素分泌颗粒上无金颗粒标记。
　　结论：
　　1.免疫电镜方法可用于胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒上IP3R-Ⅲ型的定性分析。
　　2.胰岛素分泌颗粒上确实存在IP3R-Ⅲ型。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

1 胰岛素分泌特点和作用机制

2 Ca2+对胰岛素分泌的调控

3 IP3-IP3R 对胰岛素分泌的调控

4 免疫电镜技术

正文

大鼠胰岛 β 细胞胰岛素分泌颗粒上Ⅲ型 IP3 受体的免疫电镜定位分析

0 引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

小 结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢