组织工程化同种异体椎间盘移植的体外及动物实验研究

摘要

椎间盘退行性疾病是临床常见病,多发病,严重影响患者日常工作及生活。传统治疗手段存在诸多不足之处,同种异体椎间盘移植有望克服传统治疗方式的缺陷。但临床研究证实异体间盘移植后出现了不同程度的退行性改变,这将限制椎间盘移植的远期临床效果。如能通过合适的技术手段将这一拥有巨大临床应用潜力的治疗措施予以完善,将会为椎间盘退变性疾病的治疗提供全新的治疗选择。
　　本研究中,借鉴组织工程的理念来审视同种异体椎间盘移植,我们将同种异体间盘视作椎间盘组织工程的天然支架材料,并以组织工程的技术手段来优化同种异体椎间盘的生物活性。通过复合具有生物活性的种子细胞使之组织工程化。在体外成功构建组织工程化异体间盘的基础上,拟通过大量动物实验验证细胞干预技术是否可有效延缓同种异体椎间盘移植后的退行性改变。
　　1.组织工程化同种异体椎间盘的构建及体外观察
　　目的:观察rAAV2-hTERT病毒载体转染对犬髓核细胞生活学活性的影响;探讨以rAAV2-hTERT-NPc体外组织工程化同种异体椎间盘的可行性。
　　方法:rAAV2-hTERT病毒载体以1×105v.g/cell的MOI转染犬髓核细胞。在转染后5d、10d、15d、30d及60d分别以RT-PCR、Westernbloting方法检测髓核细胞中hTERT mRNA及蛋白的表达;利用real-time PCR、Elisa法分别检测髓核细胞蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ胶原 mRNA及蛋白表达量。以上检测均与以rAAV2-EGFP转染的髓核细胞(对照组)进行对比。30个冷冻保存椎间盘随机分为3组, A组注入5×106cell/ml hTERT-NPc细胞悬液25ul作为实验组;B组注入5×106cell/ml EGFP-NPc细胞悬液25ul作为阴性对照组;C组不做处理作为空白对照。将构建完成的细胞-同种异体椎间盘支架复合体置于50ml离心管中常规条件下培养。在体外培养的第10、20及30天, DMMB法检测组织工程化椎间盘内蛋白多糖表达量并进行3组间比较。
　　结果:rAAV2可成功转染犬髓核细胞,在转染后5d,10d,15d,30d以及60d,均可于基因和蛋白水平检测到hTERT基因在髓核细胞内的表达,而在所有观察时间点内,对照组未能检测到hTERT基因表达。在转染后第10天hTERT基因表达的相对水平最高,而随着细胞传代次数的增加,hTERT基因表达也逐渐降低;RT-PCR显示在转染后的第十天至第六十天,实验组PG、COLⅡmRNA的表达量明显高于对照组细胞的mRNA表达,其高峰出现于转染后的第15天,PG、COLⅡmRNA的表达量分别较对照组增加了132％和87%,实验组与对照组在COLⅠmRNA表达上无明显差别; ELISA检测蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达量提示:在转染后的第十天,实验组 PG、COLⅡ的表达量显著增加,在转染后的第十天至第六十天,实验组髓核细胞 PG、COLⅡ的表达量均明显高于对照组。组织工程化同种异体椎间盘体外培养观察发现,椎间盘大体形态及结构保持完好,30天时可于A组椎间盘内部发现PKH-26红色荧光细胞,B组可观察到EGFP绿色荧光细胞的存在。DMMB法分析髓核组织中蛋白多糖的结果显示:3组髓核组织中的蛋白多糖含量均呈上升趋势。其中,A、B两组升高幅度明显大于C组,至第三十天时,A组PG含量明显高于两对照组,且B组较C组PG明显高表达(P<0.05)。
　　结论:使用rAAV2-hTERT病毒转染可成功实现体外培养条件下髓核细胞增殖能力及细胞外基质表达的上调,外源性种子细胞体外培养条件下可于椎间盘内部存活30天以上并促进髓核内蛋白多糖的表达,通过细胞干预技术可以实现同种异体椎间盘的功能优化,有可能实现同种异体椎间盘移植远期疗效的提高。
　　2.组织工程化同种异体椎间盘移植的动物实验研究
　　目的:通过比格犬体内原位植入实验探讨同种异体椎间盘移植的转归并观察种子细胞的介入能否延缓移植后椎间盘的退行性改变。
　　方法:12月龄beagle犬18只随机分为3组,分别植入hTERT-NPc组织工程化的同种异体椎间盘(Group A);NPc组织工程化的同种异体椎间盘(Group B)以及未组织工程化的同种异体椎间盘(Group C)。每只实验动物于术后即刻及4、8、12weeks行X线片正侧位及MRI检查,观察各组移植椎间盘的转归并测量各椎间盘高度及 MRI T2相髓核信号比灰度值进行比较;手术后3m麻醉状态下处死实验动物取L1-L7段脊柱标本进行屈伸、旋转及左右侧弯6个方向的稳定性分析比较;完成生物力学分析的腰椎标本,每组各取1个间盘,RT-PCR法检测椎间盘组织中的hTERT mRNA的表达;将剩余标本切片后行激光共聚焦显微镜观察PKH-26标记细胞;HE染色观察移植间盘组织学改变。
　　结果:通过腰椎侧前方入路可成功完成同种异体椎间盘植入手术操作,部分实验动物出现切口疝、一过性下肢神经功能障碍、移植物脱落及化脓性感染等并发症。X线及MRI检查结果显示除发生脱落并发症的两只间盘外,其余移植间盘与宿主椎体均实现了良好的骨性融合。其中C组间盘术后出现了呈进展趋势的退行性改变,至移植后12周,其椎间盘高度及髓核信号比灰度值明显低于A/B两组(P<0.05),而A/B两组退行性改变相对较轻,未见明显进展趋势;生物力学显示术后12周时,C组移植间盘出现了明显稳定性丧失;术后12周的RT-PCR分析于A组髓核内检测到hTERT mRNA的阳性表达;术后12周可通过激光共聚焦显微镜观察于实验组髓核区域内发现红色荧光细胞;组织学观察发现 A、B两组移植间盘结构保持较好,外形类似软骨细胞的髓核细胞数量较多,排列较为规则;而C组髓核形态保持欠佳,结构较为紊乱,髓核细胞数量明显减少,细胞形态欠饱满,退行性改变明显。
　　结论:同种异体椎间盘移植后可于宿主体内存活并实现良好骨性融合,外源性种子细胞体内条件下可在同种异体椎间盘内存活12周以上,通过复合种子细胞实现异体间盘的组织工程化可成功延缓椎间盘移植后的退行性改变。相对于单纯髓核细胞,rAAV-hTERT-NPc的介入具有更好的保持异体间盘功能的潜力,组织工程技术的运用有望保证同种异体椎间盘移植的远期疗效。

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文献回顾

椎间盘与椎间盘退变

一 椎间盘的结构及功能

二 椎间盘退变

椎间盘退行性疾病的生物学治疗

正文

第一部分 组织工程化同种异体椎间盘的构建及体外观察

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 组织工程化同种异体椎间盘移植的动物实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢