NRF2、HO-1基因多态性与白癜风罹患危险的关联性研究

摘要

白癜风是一种在临床中较为常见的色素障碍性皮肤病,主要累及表皮黑素细胞。近年来的研究表明,氧化应激在启动或参与黑素细胞损伤的过程中起着关键作用。作为机体最大的器官,皮肤暴露于外界环境中,当遭受各种有害刺激时,导致皮肤局部氧自由基等异常蓄积引起氧化应激状态,具有相关致病性遗传背景的个体,黑素细胞抵御氧化刺激的能力下降,过多的氧自由基进而引起黑素细胞DNA损伤,最终导致黑素细胞坏死或凋亡。进展期白癜风患者局部皮损中过氧化氢(H2O2)持续的异常蓄积被认为是氧化应激参与白癜风发病的直接证据。
　　核因子E2相关因子2(NRF2)是调节细胞抗氧化的重要转录因子,其缺失或激活障碍会提高细胞对氧化应激的敏感性,导致细胞功能异常甚至死亡。NRF2/ARE信号通路下游抗氧化靶基因血红素氧合酶1(Heme oxygenases-1,HO-1)是黑素细胞中发挥主要抗氧化作用的基因,它可通过NRF2通路保护黑素细胞抵抗氧化应激损伤。目前,仅Guan等研究发现NRF2启动子区650(C/A)与白癜风发病相关,尚无NRF2其他多基因位点及HO-1基因多态性与汉族人白癜风相关性研究。因此我们以中国汉族人群为研究对象,通过大规模临床病例-对照研究,检测分析位于启动子及内含子区的NRF2rs35652124、NRF2rs6721961、NRF2rs10183914及HO-1rs2071746单核苷酸多态性与白癜风发病的关系,并对启动子区SNP位点做初步功能学探讨,为白癜风的发病提供理论依据。
　　方法:
　　本实验通过收集1000例白癜风患者和1000例健康对照人DNA样本,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析了2个基因共4个SNP位点的基因型,SAS统计软件管理和分析白癜风患者和正常人群中的分布频率,及其与疾病的关联性。应用ELISA检测血清中血红素氧合酶1的活性在不同基因型个体中的差异,并对NRF2基因启动子区的多态性位点进行初步功能学研究,通过构建位于启动子区不同等位基因的重组质粒,瞬时转染细胞,利用荧光素酶报告系统分析基因单点突变对其转录活性的影响。
　　结果:
　　1.NRF2 rs6721961及HO-1 rs2071746位点的不同基因型分布频率在白癜风患者和正常人群间无明显差异,位于内含子区的NRF2 rs10183914 CT+TT基因型仅表现为可能增加患病风险的趋势(P=0.057,校正OR1.30,95％可信区间0.99-1.69);
　　2.位于启动子区的NRF2 rs35652124位点TT突变纯合子在汉族人群中表现为保护因素(校正OR0.75,95%可信区间0.58-0.97),相对来说野生型纯合子及杂合子CT+CC则会增加白癜风的易感性;
　　3.联合基因型对患病风险的影响分析的结果显示:以作为保护因素的突变基因型为参照,携带野生等位基因的联合基因型分布频率在疾病组和对照组间存在差异;
　　4.将NRF2 rs35652124位点基因型与白癜风临床特征的发病风险进行了关联分析,结果显示:发病年龄大于20岁的人群可能更容易罹患白癜风;
　　5.NRF2 rs6721961和NRF2 rs35652124位点应用SHEsis软件进行连锁不平衡检测,结果提示两个多态性位点存在连锁不平衡(D'=0.307,P<0.05),可能对白癜风的发病有协同作用;
　　6.同正常人群相比,白癜风患者血清中HO-1活性明显下降;但与NRF2 rs35652124位点基因多态性无明显相关;
　　7.NRF2 rs35652124位点转染活性在PIG1、293细胞中均有改变,NRF2 rs35652124T质粒转染活性高于C质粒,说明该突变位点增加启动子区活性可能为其发挥保护性作用的机制之一。
　　结论:
　　1.NRF2基因与汉族人白癜风有显著相关性,NRF2 rs35652124位点TT突变纯合子在汉族人群中患病风险降低;NRF2 rs6721961、NRF2 rs10183914及HO-1 rs20717463个多态性位点对白癜风发病无明显影响。
　　2.NRF2rs35652124多态性位点与白癜风发病有密切关系,并协同NRF2 rs6721961位点共同影响疾病发生。
　　3.血红素氧合酶单一位点基因变异及其相关重要通路中的某个基因变异可能影响蛋白表达或催化功能变异,局部皮肤黑素细胞抵抗氧化应激的能力下降,机体应对氧化损伤能力降低。进一步研究氧化-抗氧化系统中基因变异的分子机制,可为白癜风发病机理的研究和临床治疗提供线索和新方法。
　　4.NRF2启动子区rs35652124位点基因变异可能增加启动子区活性,但是否但产生新的蛋白结合位点,或原有转录因子结合特性改变,尚不能阐明。

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缩略语表

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文献回顾

实验一NRF2与HO-1基因多态性与白癜风关联研究

1 实验材料和主要设备

1.1 主要实验仪器

1.2 主要试剂

1.3 临床资料采集

1.4 血液样本采集及DNA提取

1.5 DNA浓度检测

2 实验方法

2.1 PCR-RFLP技术分析

2.2统计学分析方法

3 结果

3.1研究对象特征

3.2目的基因片段电泳和测序结果

3.3 遗传平衡检验

3.4NRF2及HO-1基因型在白癜风组与健康对照组中的分布频率（表3）

3.5 NRF2三个位点联合基因型与白癜风发病的相关性（表4）

3.6 NRF2与HO-1联合基因型和等位基因分布频率与白癜风相关性

3.7 NRF2 rs35652124位点基因分布频率与白癜风临床特征的关联分析

3.8 NRF2 rs35652124与rs6721961等位基因型分布频率与白癜风易感性关联分析（表7）

4 讨论

实验二NRF2与HO-1基因多态性的功能研究

1 实验材料和主要设备

1.1主要实验仪器

1.2主要试剂

1.3 研究对象及资料采集

1.4细胞系、载体

2 实验方法

2.1 HO-1血清活性分析

2.2 NRF2 rs35652124转录调控功能检测

3 结果

3.1血清HO-1活性分析

3.2 NRF2 rs35652124位点转录调控功能检测

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢