炎症刺激对人牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞生物学性能的影响

摘要

背景和目的:
　　牙周支持组织(periodontalsupporttissues)主要由两种软组织(牙龈和牙周膜)和两种硬组织(牙槽骨和牙骨质)。其中,牙龈组织是指覆盖于牙颈部周围及牙槽突表面的口腔黏膜上皮及下方的结缔组织,而牙周膜(periodontalligament,PDL)则是连接牙齿和牙槽骨的致密结缔组织,对牙齿的稳固和功能起着不可或缺的作用。近年来越来越多的研究表明,牙周膜组织中也存在未分化的、具有自我更新和多向分化潜能的细胞,一般称为牙周膜干细胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs),这些细胞是牙周支持组织再生和重建的基础。因此,在牙周组织破坏的病理条件下,利用体外培养扩增的干细胞(如PDLSCs或其他牙源性组织来源的干细胞)进行细胞移植,有望解决牙周再生面临的困难和挑战,具有重要的临床意义。
　　虽然牙周干细胞治疗首选PDLSCs,但PDLSCs取材困难,来源有限,大大限制了其临床应用的潜能。而同属牙周支持组织的牙龈组织,取材容易、方便,取材后组织愈合快、能够无疤愈合,如能从牙龈组织中获得具有牙周组织再生能力的干细胞,将极大推动干细胞治疗牙周病的临床转化潜能。现有研究证实,人牙龈组织中的确存在具有自我更新、多向分化潜能和免疫调节作用的干细胞,一般称为牙龈间充质干细胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)。虽然体内外实验均证实GMSCs具有良好的形成软硬组织的能力,GMSCs是否可以作为PDLSCs的代替细胞,用于牙周病的治疗,还需要进一步深入研究。
　　为探讨GMSCs用于牙周组织工程的可行性,我们首次将GMSCs和PDLSCs的基本生物学性能进行系统的对比研究分析;同时考虑到利用干细胞进行牙周治疗的过程中,植入的干细胞将面临一个具有大量炎性因子存在的微环境(牙周炎微环境),本实验中,我们进一步体外模拟牙周炎的炎症微环境,观察两种干细胞对炎性刺激的反应,为GMSCs用于牙周再生治疗的选择提供实验依据。
　　方法:
　　第一部分:GMSCs与PDLSCs的培养、鉴定和生物学性能的对比分析
　　来源于同一个体的正常牙龈和牙周膜组织进行配对细胞的原代培养,通过低密度接种法获得GMSCs和PDLSCs;采用流式细胞仪进行细胞表面标志物的检测,绘制细胞生长曲线及计算克隆形成率,比较两种干细胞的增殖能力;进一步通过成骨、成脂、成软骨能力的对比观察和定量分析,通过RT-PCR对相关基因的表达进行检测,综合比较两种干细胞的生物学性能。
　　第二部分:炎性刺激对两种细胞分化和体内骨形成能力的影响
　　以IL-1β(5ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)两种炎性因子构建体外炎症微环境;观察比较体外炎症微环境中两种干细胞的分化能力的影响。采用茜素红染色、ALP染色、ALP定量及实时定量PCR等方法,比较两种干细胞在炎症环境下成骨、成脂能力的改变及炎症刺激对干细胞性能影响的程度;最后,将正常与炎症环境下成骨诱导的GMSCs与PDLSCs膜片分别与骨支架材料复合,植入裸鼠背部皮下,8周后切片染色,观察比较两种干细胞在不同环境下经诱导后异位骨形成能力。
　　结果:
　　第一部分
　　1、原代细胞经单细胞克隆获得相对纯化的干细胞,细胞表面标志物的检测显示两种组织来源的干细胞对间充质干细胞标志物STRO-1、CD146、CD105、CD90、CD29表达均呈阳性,而对造血系标志物CD45和内皮系标志物CD31表达均呈阴性。两种细胞的干细胞表型相似,无明显统计学差异(P>0.05)。
　　2、两种干细胞的生长曲线和克隆形成率配对比较:GMSCs的增殖能力明显强于PDLSCs(P<0.05)。
　　3、体外成骨、成脂、成软骨能力比较及相关基因表达检测显示,两种干细胞均具有较强的分化能力,PDLSCs成骨能力和成软骨能力要显著高于GMSCs(P<0.05);而GMSCs的成脂能力要强于PDLSCs,但无统计学意义(P>0.05)。
　　第二部分:
　　1、两种干细胞的体外成骨能力在炎症刺激下均受到显著性抑制(P<0.05),且PDLSCs成骨能力抑制程度相对GMSCs更为明显(P<0.01)。
　　2、两种干细胞的成脂能力在炎症刺激下也都受到不同程度抑制,但抑制作用经统计学分析,无显著性差异(P>0.05)。
　　3、两种细胞经炎症刺激后,植入裸鼠皮下,8周后骨形成定量分析结果显示:炎症刺激后,两种细胞异位骨形成能力均显著降低(P<0.05);PDLSCs成骨能力受到的影响与GMSCs相比,更为明显(P<0.01)。
　　结论:
　　牙龈和牙周膜组织中均存在着大量的间充质干细胞,这些间充质干细胞均具有良好的成骨、成脂及成软骨的特性,并具有较强的异位成骨能力。在正常培养条件下,PDLSCs相比GMSCs具有更好的骨向分化潜能,但其来源有限,大大限制了进一步的临床应用。而GMSCs来源广泛,具有和骨髓、牙周膜及其他组织来源的间充质干细胞相似的特性及免疫调节能力。通过实验我们发现,在炎症刺激下GMSCs和PDLSCs的骨向分化能力都有下降,但是GMSCs受炎症刺激的影响相对较小,显示了较强的抵抗炎症刺激的能力,这可能与GMSCs的免疫调节能力有关。我们的研究结果提示GMSCs可能因其较强的抵御炎症刺激的能力,成为在牙周再生治疗中又一种可供我们临床医生选择的重要细胞资源。

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缩略语表

中文摘要

前言

文献回顾

一、组织工程技术在牙周再生领域的应用

二、牙组织工程相关干细胞

三、炎症因子

正文

第一部分 人牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞的分离、培养与鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 炎症刺激对人牙龈间充质干细胞和牙周膜干细胞生物学性能的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

临床病例

附图

个人简历和研究成果

致谢