富血小板衍生物及与牙周膜干细胞复合促脱位再植牙牙周膜愈合的研究

摘要

牙撕脱性损伤是指外力撞击后牙齿由牙槽窝中脱出、牙周膜和牙髓被同时彻底撕脱的一类损伤,它是牙外伤中发生率较高的一类疾病,但其治疗难度大且预后很不稳定。大多数撕脱性患牙在就诊时已出现牙周膜的广泛损伤甚至坏死,勉强再植后形成病理性愈合甚至牙齿脱落。以往的研究证实,撕脱性损伤患牙的牙周愈合与牙根表面活细胞的数目,尤其是与牙周膜组织中干细胞的数量密切相关,因此,有学者对适合牙周再生的干细胞类型进行了筛选并确定牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)为理想的种子细胞。单纯地将PDLSCs用于脱位再植牙中,虽能促进其牙周愈合,但仍不能达到理想的牙周膜性愈合。究其原因,PDLSCs在牙周组织工程中可以通过两条途径发挥作用:一是外源性干细胞直接局部植入参与牙周修复,二是损伤的牙槽窝内壁、牙根表面余留的内源性干细胞动员、经细胞归巢聚集于牙周缺损区域参与修复。无论哪一种途径,参与牙周再生的内源性或外源性PDLSCs的分化命运都受控于其培养环境。在体内,生长因子、细胞因子等信号分子形成网络调控的微环境,精细地调控干细胞的增殖和分化;而在体外,则需要人为地模拟体内这种复杂的微环境,常用的方法是添加多种外源性生长因子,模拟体内信号分子间的相互作用,从而实现对细胞增殖、分化的调控,最终达到形成组织的目的[1]。然而,生长因子在牙周组织工程中的应用目前还存在很大的局限性,究其原因在于外源性生长因子存在成本高、纯化难、半衰期短等问题,而且要使其在体内维持长时间的作用,则需要一个持续传递的系统来确保生长因子能在一定时间内维持在机体所必需的浓度水平,而生长因子的复合、控释等问题目前都还存在技术瓶颈。富血小板衍生物的出现很好地解决了这一难题,其所含有的天然比例的复合生长因子能够调控与组织修复密切相关的细胞的增殖、分化和凋亡,并且各生长因子作用的发挥并不是独立存在的,而是相互促进、相互协同、相互调控,构成强大的网络调节系统,从而发挥促进组织修复甚至再生的作用。富血小板衍生物自发现以来已被用于骨、软骨等组织缺损的修复,但其在牙周组织修复与再生中的研究较少,多限于复杂牙周病治疗的个案报道,其对牙周细胞的生物学效应及机理尚未见报道,对于其是否可在撕脱再植牙牙周损伤修复中发挥促进作用也尚不清楚。本研究则拟深入分析富血小板衍生物的制备方法及其促牙周组织修复与再生效应,进一步采用组织工程的方法,将牙周膜干细胞作为种子细胞,并制备成细胞膜片片段形式,同时将富血小板衍生物PRP/PRF作为细胞支架材料和生长因子的来源,构建新型高效促牙周膜再生修复的复合体移植物,以保证干细胞具有复合生长因子持续支持的微环境,以期最大程度地促进其发挥牙周组织修复和再生潜能,为突破目前脱位牙体外存留时间的极限、使原本无保留希望的延迟再植牙也能获得理想的牙周膜性愈合提供新的思路与契机。
　　本实验分为两大部分:
　　第一部分:富血小板衍生物对脱位再植牙牙周膜愈合影响的研究。
　　1、采用不同离心方法制备富血小板血浆(PRP),对其回收的血小板数量及形态进行检测筛选出较为理想的PRP制备方法,同时按照标准的400 g/min的离心速度制备富血小板纤维蛋白(PRF),对二者进行组织学观察和超微结构观察,以明确其结构特点。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)对二者含有的生长因子进行定量检测及分析。
　　2、采用犬作为实验动物,间隔拔除上下颌前牙,建立完全性牙脱位模型。自颈静脉抽取全血,按照第一部分实验方法制备PRP和PRF。将脱位牙按照体外干燥放置30 min、1 h和2 h进行随机化分组,每组的患牙又分别复合PRP、PRF或不添加任何移植物进行再植,以即刻再植作为对照组。采用组织学观察评价各组患牙牙周愈合情况。
　　第二部分:牙周膜干细胞复合富血小板衍生物促延迟再植脱位牙牙周膜愈合的实验研究。
　　1、联合应用酶消化法和组织块法分离培养原代人牙周膜细胞,采用有限稀释法分离PDLSCs,并对其干细胞特性进行鉴定,包括采用克隆形成实验鉴定其克隆形成能力,采用MTT法测定其生长曲线,采用成脂、成骨诱导培养检测其多向分化潜能。
　　2、将不同浓度的PRP和对应剂量的PRF与自体PDLSCs共培养,采用MTT法检测其对细胞活性的影响,采用细胞计数的方法检测细胞增殖能力的变化,采用碱性磷酸酶活性测定、成骨相关基因BSP和OCN,以及成牙周膜相关基因CP23、Col-I的real-time PCR检测明确PRP/PRF对PDLSCs分化的影响。
　　3、体外构建双膜结构复合物PDLSCs/PRF。该部分是将PDLSCs制备成细胞膜片的形式,同时将PRF制备成坚韧的膜状结构,采用不同的方法对二者进行复合,对复合体的超微结构进行观察,筛选出二者最佳的复合方式,以便更好地将其应用于体内,最大程度上发挥二者的作用。
　　4、体外分离培养犬牙周膜干细胞,将其制备成细胞膜片片段的形式,体外构建双膜结构复合物 PDLSCs/PRF并用于犬脱位牙的延迟再植中,同时将其与PDLSCs/PRP、PDLSCs、PRP/PRF等移植物的牙周修复效果进行对比研究。
　　本研究的结果发现:
　　1、通过对全血离心可以成功制备富血小板衍生物 PRP/PRF,组织学观察证实二者均为胶原纤维网状结构,均含有大量比例与生理状况一致的生长因子,包括表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF-1)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor-AB,PDGF-AB)、转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等,且PRF中的生长因子呈持续性缓慢释放。将自体富血小板衍生物局部应用于脱位牙再植,PRP和PRF均能明显促进脱位牙牙周愈合,减少其病理性吸收,尤以PRF作用更为显著,但其修复效果与脱位时间呈负相关,即延迟再植时间越久,修复效果越差。当脱位时间突破目前再植极限2小时后,即使局部使用PRP/PRF也不能有效促进脱位牙再植后的牙周愈合。
　　2、有限稀释法能够成功分离得到 PDLSCs,后者具有良好的增殖能力和克隆形成能力,具有和骨髓间充质干细胞相似的表面分子标志,具有向成脂、成骨等不同方向分化的潜能。富血小板衍生物 PRP/PRF能够明显促进细胞增殖及向牙周膜方向分化,表现为牙周膜主要成分Col-I和牙骨质蛋白CP23基因的上调;但其对细胞成骨分化有一定的抑制作用,表现为成骨相关指标 ALP活性的下降和成骨相关基因BSP、OCN的下调。
　　3、将PDLSCs制备成大小约0.5mm×0.5mm细胞膜片片段的形式,将PRF膜制备成大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm的颗粒状,二者按照一定比例机械混匀即可得到结构良好的PDLSCs/PRF双膜结构复合物。超微结构显示,细胞可以牢固粘附于PRF表面,并伸出大量伪足至PRF三维网状结构中,二者相互嵌合,形成整体。该复合体移植物不但大幅度提高了细胞密度、保存了细胞外基质成分,还满足了种子细胞、支架材料和生长因子等组织工程三要素,并具有较强的可塑性。将该双膜结构复合物用于脱位时间超过2小时的延迟再植脱位牙,能够明显促进脱位牙牙周膜愈合,表现为胶原纤维紧密排列的牙周膜样组织的大量再生及患牙病理性愈合的减少。
　　小结:本研究首次将牙周组织工程理念引入脱位牙的治疗中。体外分离培养种子细胞PDLSCs,在充分探究了富含天然比例复合生长因子的富血小板衍生物的制备方法及其对 PDLSCs的生物学效应的基础上,创新性地于体外构建了基于干细胞膜片片段与PRF膜颗粒的双膜结构复合体 PDLSCs/PRF,并将其应用于脱位牙的延迟再植中,观察其对延迟再植脱位牙牙周膜损伤修复的影响。研究发现,富血小板衍生物 PRP/PRF可通过显著促进PDLSCs的增殖及牙周膜向分化,从而发挥促脱位牙牙周膜愈合、减少其病理性吸收的作用。但当患牙脱位时间突破目前再植极限2 h后,单纯局部使用PRP/PRF也不能有效促进脱位牙再植后的牙周膜愈合,此时采用外源性膜片化 PDLSCs的膜片片段复合 PRF膜颗粒所构建的新型复合体移植物PDLSCs/PRF,能够有效促进脱位2h以上患牙延迟再植后的牙周愈合,从而最大程度地促进外源性干细胞发挥其牙周再生与修复的潜能。本研究为突破目前脱位牙体外存留时间的极限、使原本无保留希望的延迟再植牙也能获得理想的牙周膜性愈合提供了新的契机与研究基础。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1. 完全脱位牙的愈合方式及影响因素

2. 牙周组织修复和再生的研究

3. 细胞膜片在牙周再生方面的研究

4. 富血小板衍生物的特点及应用

正文

第一部分 富血小板衍生物对脱位再植牙牙周膜愈合影响的研究

实验一 富血小板衍生物的制备及检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验二 富血小板衍生物用于脱位牙再植的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 牙周膜干细胞复合富血小板衍生物促延迟再植脱位牙牙周愈合的实验研究

实验一 牙周膜干细胞的分离、鉴定及膜片化培养

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验二 富血小板衍生物对PDLSCs增殖分化影响的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验三 PDLSCs/PRF复合体移植物体外构建方法的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验四 自体PDLSCs复合富血小板衍生物促延迟再植脱位牙牙周愈合的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢