乙酰化白藜芦醇对大鼠海水吸入型肺损伤的保护作用研究

摘要

研究背景:
　　淹溺是一个重大但时常被忽视的公共卫生问题,据不完全统计,每年约有50万人死于淹溺。肺脏是吸入海水后首先受到侵害的重要脏器,研究表明吸入海水所致肺损伤明显比吸入淡水严重。海水吸入型肺损伤(SeawaterInhalationInducedAcuteLungInjury,SWI-ALI)主要表现为肺部炎症反应和肺水肿,具体发生机制较为复杂,可以肯定的是损伤的严重程度取决于液体的吸入量和清洁程度。海水吸入型肺损伤病情发展迅速,如未及时治疗或处置不当易发展为海水吸入型呼吸窘迫综合征(SeawaterInhalationInducedAcuteRespiratoryDistressSyndrome,SWI-ARDS)。近年来,对海水吸入型肺损伤发病机制和救治的研究日益增多,但是对其发病机制尚未形成统一认识,未能提出切实有效、有针对性的治疗措施。
　　核转录因子κB(NF-κB)是一种几乎存在于所有哺乳动物细胞内的转录因子,参与细胞增殖、分化、凋亡和癌变等多种病理生理过程。通常细胞中NF-κB与IκB结合存在于细胞浆中;当受到LPS、TNF-α和IL-1等刺激时,IκB被迅速降解,游离状态的NF-κB转移入细胞核,与相应目的基因结合并促使其转录,发挥相应的生物学功能。NF-κB调节多种效应分子的表达,介导组织损伤与修复;其中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)是其重要的下游调节因子,三者共同参与多种疾病的发生于发展。在此理论基础上,NF-κB相关信号通路在海水吸入型肺损伤中的作用成为本课题的研究重点。
　　白藜芦醇(Resveratrol)是广泛存在于多种植物体内的多酚化合物,是一种植物抗毒素,具有多种生物活性,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤细胞增殖和抗细胞老化等;因此,近年来对白藜芦醇的研究较为多见。然而,由于白藜芦醇生物半衰期短和血药浓度低等原因,其临床应用始终面临种种困难。乙酰化白藜芦醇是白藜芦醇三个羟基被乙酰基取代后的产物,在体内转化为白藜芦醇发挥药理活性,并且能够增加白藜芦醇在肺部蓄积浓度同时延长生物半衰期,前期研究表明乙酰化白藜芦醇能够通过抑制活性氧类(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成降低γ-射线照射时小鼠的死亡率。在本研究中,我们通过体内试验观察大鼠吸入海水后肺部损伤性变化及乙酰化白藜芦醇的保护作用;在细胞实验中,我们采用白藜芦醇,乙酰化白藜芦醇的代谢产物,研究其保护作用的具体机制。
　　实验目的:
　　(1)明确乙酰化白藜芦醇能否抑制炎症反应和氧化损伤减轻海水吸入型肺损伤;
　　(2)进一步探讨乙酰化白藜芦醇抗炎、抗氧化的具体信号转导机制,尤其是NF-κB、iNOS和HIF-1α等信号分子在其中的作用;
　　(3)细胞试验验证相关信号通路在海水吸入型肺损伤中的作用。
　　实验方法:
　　实验一:
　　健康雄性SD大鼠按照完全随机的方法分为6组:A组:空白对照组;B组:海水吸入型肺损伤模型组;C组:乙酰化白藜芦醇低剂量(50mg/kg)组;D组:中剂量组(150mg/kg);E组:高剂量组(450mg/kg)预处理组;和F组:PDTC预处理组(100mg/kg)。各预处理组从造模前7天开始每天灌胃相应药物,最后一次灌胃90分钟后造模,向实验大鼠气管内滴注配方海水4ml/kg。造模4小时后放血处死取肺组织标本。采用HE染色的方法观察各组大鼠肺组织结构损伤变化;通过ELISA的方法检测肺组织中TNF-α和IL-1β的含量,分别采用硫代巴比妥酸(ThibabituricAcidTBA)法和黄嘌呤氧化酶法测定肺组织中MDA含量和T-SOD活性,用WesternBlot的方法检测NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量。以评价乙酰化白藜芦醇对海水吸入后所致炎症和氧化损伤的改善作用。
　　实验二:
　　将处于指数生长期的A549细胞分为4组,A:正常培养组;B:海水刺激组;C:白藜芦醇干预组;D:PDTC预处理组。C组和D组在分别加入200μmol/L白藜芦醇和PDTC30分钟后进行海水刺激。同时向B、C和D组加入含有25％配方海水的培养基,正常培养4小时后弃去培养基进行免疫荧光染色操作,检测细胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量。
　　实验结果:
　　实验一:
　　与空白对照组相比,大鼠吸入海水后肺组织结构受到破坏,肺泡壁增厚并伴有局部塌陷;肺泡腔和肺间质内可见大量水肿液渗出和炎细胞浸润;肺组织内代表损伤效应的TNF-α、IL-1β、MDA和NO等表达量增加(P<0.05),而代表抗损伤效应的T-SOD活性降低(P<0.05);同时,海水吸入能够导致NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量增高(P<0.05)。然而,乙酰化白藜芦醇预处理组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、MDA和NO表达量相对降低(P<0.05),T-SOD表达量增高(P<0.05),且高剂量组效果最为明显(P<0.01);同时,乙酰化白藜芦醇降低肺组织中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量(P<0.05),且干预效果与PDTC无明显差异(P>0.05)。
　　实验二:
　　与正常培养的细胞相比,海水刺激后A549细胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量明显增高,而乙酰化白藜芦醇体内代谢产物白藜芦醇预处理后NF-κB、HIF-1α和iNOS的表达量显著降低,与PDTC效果无明显差异。
　　结论:
　　NF-κB及其下游的信号分子HIF-1α和iNOS构成的信号通路参与海水吸入型肺损伤的发生与发展;乙酰化白藜芦醇能够通过干预此信号通路的表达,抑制下游炎症因子等的表达减轻海水吸入所致的肺部炎症和肺水肿。

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文献回顾

正文

第一部分 乙酰化白藜芦醇对海水吸入型肺损伤的保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 乙酰化白藜芦醇干预海水吸入型肺损伤的分子机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢