西北地区鼻咽癌转移相关基因的高通量表达筛选和功能研究

摘要

背景和目的:
　　远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因,其分子机制有待深入探索。远处转移是多基因参与、多步骤相互作用的复杂过程。高通量的表达筛选是发现肿瘤转移相关基因的重要方法,但目前鼻咽癌转移相关基因的筛选大多来源于细胞系,无法真实模拟体内的情况,另外,大多数的研究来自于鼻咽癌高发区,非高发区的研究相对较少。本研究首次利用鼻咽癌转移和无转移组织标本,利用全基因组表达谱芯片芯片筛选中国西北地区鼻咽癌转移相关基因,并分别在细胞系的mRNA、蛋白水平及组织标本中进行表达和功能验证。本研究将有望发现多个新的非高发区鼻咽癌转移相关重要基因,为鼻咽癌转移的临床诊治提供新的靶点。
　　方法:
　　1、临床标本选取西北地区以转移为首发症状的和随访满3年无转移的鼻咽癌原发灶组织各3例,采用含41,000个人类功能基因的安捷伦全基因组表达谱芯片检测,比较两组基因表达谱的差异性,筛选具有2倍以上表达差异的基因,使用GoMiner软件分析差异基因的功能;使用KEGG软件对差异基因进行通路分析。
　　2、实时荧光定量PCR及免疫组织化学染色的方法对候选转移相关基因的进行mRNA及蛋白水平的验证,以确定芯片结果的可靠性,同时利用Westernblot检测不同转移潜能鼻咽癌细胞系(5-8F和6-10B细胞)各候选基因的表达情况。
　　3、采用siRNA技术干扰候选转移相关基因MAZ、DMBT1基因在高转移鼻咽癌细胞5-8F和低转移细胞系6-10B中的表达,WesternBlot验证转染效果。利用细胞划痕实验、Transwell实验观察5-8F、6-10B细胞株迁移、侵袭能力的变化,探讨MAZ、DMBT1对5-8F及6-10B细胞系转移表型的影响。
　　4、收集鼻咽癌患者的组织标本,利用免疫组化检测MAZ和DMBT1基因的表达与鼻咽癌患者临床资料的相关性,采用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用独立样本的t检验和秩和检验,P<0.05差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、转移组和未转移组基因表达谱结果:按差异倍数2倍,FDR<10％标准进行筛选,结果显示转移和非转移鼻咽癌组织相比,有2314个基因上调,2417个基因下调。采用差异倍数10倍为标准筛选,70个基因上调,57个基因下调。本研究首次发现MAZ、DMBT1、SFTPB三个基因在非高发区鼻咽癌转移组和未转移组的差异表达,是潜在的鼻咽癌转移相关基因。
　　2、通过GoMiner和KEGG对差异倍数达2倍以上的基因进行GO分析和通路分析发现:上调基因共参与501个BP分类,参与125个CC分类,参与98个MF分类;下调基因参与333个BP分类,37个CC分类,72个MF分类。Pathway分析显示转移上调基因共参与35条pathway,下调基因共参与29条pathway,P值均<0.05。
　　3、实时荧光定量PCR和免疫组化检测组织中MAZ、DMBT1、SFTPB的表达与芯片结果具有良好的一致性,高转移组织中MAZ表达上调,DMBT1、SFTPB下调。WesternBlot检测高转移细胞系5-8F细胞中MAZ的表达上调,DMBT1、SFTPB表达下调,低转移细胞系6-10B细胞中MAZ表达下调,DMBT1、SFTPB上调。
　　4、用MAZ和DMBT1的siRNA分别转染5-8F、6-10B细胞,WesternBlot检测证实转染后其蛋白表达明显降低。划痕实验和Transwell实验表明转染MAZsiRNA后,5-8F细胞迁移、侵袭能力明显减弱;转染DMBT1siRNA后,6-10B细胞迁移、侵袭能力显著增强。
　　5、免疫组化检测MAZ和DMBT1表达与鼻咽癌临床资料相关性,结果提示:在远转组、N分期晚、T分期晚、未分化型癌的病人中,MAZ表达较高(P<0.05),DMBT1在未转移组、分化型,其表达量较高(P<0.05)。SFTPB在转移组和未转移组、不同T、N、临床分期、病理类型之间表达差异未达统计学差异。
　　结论:
　　通过全基因组芯片筛选技术,我们发现MAZ、DMBT1、SFTPB这三个基因可能是西北非高发区鼻咽癌转移相关的重要基因。我们进一步对MAZ和DMBT1基因进行了深入研究。其中,MAZ是潜在的促鼻咽癌转移基因,其在高转移鼻咽癌组织和细胞系中的表达显著升高,下调MAZ的表达,可以显著抑制高转移鼻咽癌细胞系的迁移和侵袭能力。DMBT1是潜在的鼻咽癌转移抑制基因,其在低转移的组织和细胞系中的表达显著上调,下调DMBT1的表达可以显著促进低转移鼻咽癌细胞系的迁移和侵袭能力。临床资料的相关性分析发现:MAZ在未分化鼻咽癌的表达水平较高,且其高表达和鼻咽癌的淋巴结和远处转移密切相关。DMBT1在分化型鼻咽癌的表达水平较高,且其低表达和鼻咽癌的转移密切相关。

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封面

声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、肿瘤转移的分子机制

二、鼻咽癌转移的分子机制

三、高通量筛选技术在鼻咽癌转移研究中的应用

正文

实验一 西北地区鼻咽癌转移相关基因的全基因组表达谱芯片筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 候选基因MAZ、DMBT1、SFTPB的表达验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 MAZ、DMBT1介导鼻咽癌细胞转移的功能研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 MAZ、DMBT1、SFTPB表达与鼻咽癌临床资料相关性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢