致密层在骨软骨复合支架修复兔关节骨软骨缺损中作用的研究

摘要

由于创伤、疾病等原因,常常导致关节软骨的缺损,易发展为骨性关节炎(osteoarthritis OA),给患者带来巨大的痛苦。关节软骨无血液供应,加之软骨细胞为分裂、增殖和代谢不活跃的稳定细胞,因而其自身修复能力极差。此外,关节软骨全层缺损后,位于其下的软骨下骨往往会出现退变、硬化等病理改变,而新生软骨是无法与硬化、退变的软骨下骨进行整合的,故关节软骨缺损的修复必须考虑同时修复病变的软骨下骨。到目前为止,临床上采用的多种外科治疗方法,均未能获得满意的治疗效果。组织工程技术的进步,给关节骨软骨损伤的修复再来希望。近十年来,已有部分学者使用骨支架与软骨支架的复合体,来修复关节骨软骨损伤。虽然获得了部分成功,但仍有两大问题制约其在临床上推广:一,软骨支架与骨支架之间的结合力差,在关节内不能承受各种应力,经常发生断裂现象;二,骨软骨复合支架上的种子细胞的增殖、分化能力差,骨软骨组织的修复情况不佳。
　　要解决以上两大问题,必须要对骨软骨的组织结构和细胞的生存环境有个充分的理解。正常关节面由软骨和软骨下骨构成。在微观结构上,软骨分四层:浅表层、移行层、柱状层和钙化层。钙化层结构致密,实质上是软骨与软骨下骨的过渡层,起着隔离软骨和软骨下骨的作用,同时将二者牢固地整合在一起。软骨营养主要来源于关节腔滑液,而关节液中的氧浓度明显低于软骨下松质骨的氧供浓度。软骨细胞适应低氧环境,低氧条件下有利于软骨细胞的分化、增殖。如果血液一旦侵入关节腔内,其中一些成分会因触发炎性反应而导致新生软骨细胞凋亡或坏死。与此同时,如果关节液渗透入软骨下骨,亦有害于成骨细胞,严重影响其活性。由此可见,尤其对于修复能力差的软骨细胞来说,钙化层是维持其良好状态必不可少的条件。理想的骨软骨组织工程支架应模拟正常关节的骨软骨结构,在复合骨软骨支架中制备相当于钙化层的结构,才能更好地促进关节骨软骨缺损的修复。
　　本课题组在前期实验中,利用物理粉碎和化学脱细胞相结合的方法,提取了牛关节软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。并采用了温度梯度热诱导相分离(temperature gradient-guided thermal-induced phase separation,TIPS)技术,制备出具有定向微管结构的软骨支架。以β-磷酸三钙(tricalcium phosphate,β-TCP)、聚丙交酯-乙交酯共聚物[poly(1actic-co-glycolic acid),PLGA](两者配比7:3)与Ⅰ型胶原作为原材料,采用快速成形(rapid prototyping,RP)技术和低温沉积铸造(low-temperature deposition manufacturing,LDM)法,制备了具有三维结构、内层为PLGA/β-TCP、表面包裹Ⅰ型胶原的包芯结构骨支架材料。经实验证实,此两种软骨支架与骨支架具有良好的加工和成型特性、较高的空隙率、优秀的亲水性和生物相容性、适合的机械强度和降解速度,能够满足骨与软骨组织工程的理想支架材料的要求。
　　本实验模拟钙化层结构,在软骨支架与骨支架之间增加了致密层,目的是牢固地将两者整合起来,以提高骨软骨复合支架的机械力学性能;同时,希望在骨软骨复合支架植入体内后,致密层能将软骨支架和骨支架上结合的细胞分隔在关节腔和骨髓腔的封闭环境内,以利于种子细胞分别向软骨细胞和成骨细胞分化和增殖,利于骨软骨组织的修复。具体的研究内容如下:
　　第一部分具有致密层的骨软骨复合支架的制备及致密层特性的研究
　　本实验同样采用快速成型技术,在骨支架表面喷涂 PLGA/β-TCP,形成一厚约0.5mm的致密层。通过“溶解-粘连”工艺,将软骨支架与致密层相连。这样,带有致密层的骨软骨复合支架构建即可完成。本实验还制作了没有致密层的骨软骨复合支架,即骨支架与软骨支架也是通过“溶解-粘连”工艺,直接相连。以具有致密层的骨软骨复合支架为实验组,没有致密层的为对照组。
　　使用电子扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)对致密层进行观察,对致密层的孔隙率、吸水率以及液体和细胞对其通透性进行检测,并对具有致密层和没有致密层的两组骨软骨复合支架的力学性能进行了检测和比较。
　　实验结果显示:致密层的孔隙率、吸水率极小,有较强的疏水性,对液体和细胞无通透性;实验组骨软骨复合支架的最大抗拉伸力、抗剪切力显著高于对照组(P<0.05)。以上结果提示:致密层有将软骨细胞和成骨细胞分隔在不同的环境中的能力,并且致密层能显著地增强骨软骨复合支架的力学性能。
　　第二部分致密层在体外构建组织工程骨软骨复合物中作用的研究
　　本实验从成年兔髂骨骨髓中提纯、扩增骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)后,使用不同的诱导剂,诱导其分别向软骨细胞和成骨细胞方向分化。然后将带致密层的骨软骨复合支架置于本课题组自制的骨软骨培养腔中,通过滴注法,把诱导形成的软骨细胞与成骨细胞分别接种于复合支架的软骨支架与骨支架上,继续使用诱导剂,分别向软骨细胞、成骨细胞方向诱导和培养。由于致密层的存在,软骨支架与骨支架上的细胞被分隔在不同的环境中。利用扫描电镜观察细胞在骨软骨复合支架内粘附的形态,采取MTT法了解细胞在支架上增殖的情况,使用多种染色方法检测BMSCs向软骨细胞和成骨细胞的分化情况。
　　SEM观察可见,在有致密层隔离的条件下,细胞在支架上伸出长长的伪足,细胞变成扁平状并相互接触、接连成片,深入支架孔隙的深处,完全覆盖支架孔隙的表面。MTT法检测结果可见,随着培养时间的延长,骨软骨复合支架上的细胞数量均显著地升高。细胞在支架上诱导、培养20d后,将向软骨细胞和成骨细胞诱导的BMSCs分别从支架上消化下来,分别添加软骨培养基和成骨培养基,继续培养、诱导24h。向软骨细胞诱导的BMSCs使用番红O、甲苯胺蓝、II型胶原的免疫组化染色,均呈阳性,而 I型胶原的免疫组化染色阴性;向成骨细胞诱导的BMSCs使用BCIP/NBT底物行碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP),使用茜素红法行钙结节染色,均呈阳性。
　　以上结果表明,在致密层将软骨支架和骨支架上的细胞分隔在两个不同的培养环境中后,细胞能够在支架上良好地粘附和增殖,显示典型的软骨细胞和成骨细胞的分化表型,无退化现象的发生,在体外可成功构建组织工程骨软骨复合物。
　　第三部分致密层在体内修复兔关节骨软骨缺损中作用的研究
　　本实验将结合经诱导的自体BMSCs的骨软骨复合支架回植入兔膝关节骨软骨全层缺损处,于术后3月和6月分别取材,通过对新生软骨进行大体形态观察、压缩模量和分子生物学检测,对新生软骨下骨进行骨矿物质密度(bone mineral density,BMD)检测,以及对新生骨软骨组织进行显微计算机断层扫描(Micro-computed tomography, Micro-CT)三维重建、组织学染色观察,验证致密层在体内对骨软骨复合支架修复关节骨软骨全层缺损的影响。
　　新生软骨的大体观察可见,与对照组软骨支架比,实验组软骨获得了较为满意的修复。实验组新生软骨的大体形态评分结果、压缩模量、Ⅱ型胶原及其mRNA的表达均明显高于对照组(P<0.05),术后6月,其数值与正常软骨支架相比,无显著差异(P>0.05)。
　　新生骨软骨的组织学染色可见,实验组的新生骨软骨组织的形态更优于对照组,尤其是在术后6月,接近于正常骨软骨组织。实验组新生的骨软骨的组织评分结果均显著高于对照组(P<0.05)。此外,Micro-CT三维重建的结果,与组织学染色完全吻合。实验组的新生软骨下骨的BMD值亦显著高于对照组。
　　以上实验结果显示,相对于对照组,实验组新生骨软骨组织在形态学、生物力学、分子生物学方面,均获得较好的结果。表明:在体内,由于致密层的存在,成骨细胞和软骨细胞增殖、分化良好。
　　因此,致密层在骨软骨复合支架修复关节骨软骨缺损中,具有重要作用。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 关节骨软骨组织的构成和特征

2 关节骨软骨的修复

3骨软骨组织工程

正文

第一部分 具有致密层的骨软骨复合支架的制备及致密层特性的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 致密层在体外构建组织工程骨软骨复合物中作用的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

第三部分 致密层在体内修复兔关节骨软骨缺损中作用的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢