大麻素I型受体参与异氟醚预处理诱导的大鼠脑缺血耐受

摘要

缺血性脑卒中是由于各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍,引起脑组织缺血缺氧性病变坏死,进一步导致引起神经功能缺失的脑血管性疾病。在发达国家中,缺血性脑卒中是仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。我们国家现存脑卒中病人800多万,其中主要是缺血性脑卒中,而每年仍以8.7％的速度上升;脑卒中每年给我国带来的社会经济负担多达400亿元。在过去二十年,虽然在缺血性脑卒中的诊断和治疗上都取得了不少的进步,但是其死亡率仍然居高不下。这主要是由于缺血性中风发病急,早期的溶栓治疗时间窗有限,很多病人并不能得到及时有效的治疗。因此缺血性脑卒中的损伤机制和防治研究一直是神经科学的热点问题。
　　预处理概念的提出为神经保护作用的研究开辟了一条崭新的道路。早在90年代,Kitagawa等研究发现,缺血预处理可以诱导脑缺血耐受,产生脑保护作用。随后人们又研究发现,许多药物(如LPS、TNF-α、IL-1)都可以模拟缺血预处理,产生神经保护作用。然而,由于这些方法本身的局限性,使它们不能广泛应用于临床。异氟醚是一种临床广泛应用、安全性较好的吸入性麻醉剂。自从Newberg在实验中首次发现异氟醚可以降低大脑耗氧量,产生脑保护作用以来,异氟醚预处理的中枢神经保护作用已经被大量研究证实,然而它的神经保护机制仍不清楚。
　　内源性大麻素是机体对抗兴奋性毒性损伤第一道防线的重要组成部分。在动物脑损伤模型中发现,给予内源性大麻素或大麻素受体激动剂可以产生神经保护作用,而选择性大麻素I型受体(CB1)受体拮抗剂AM251可以逆转这种保护作用。并且CB1受体作为含量最丰富的神经调节受体之一,在脑组织中有着广泛的表达。以往研究发现Ca2+内流可以启动内源性大麻素的合成,而异氟醚预处理可以增加神经元内Ca2+的内流。这些提示我们,异氟醚预处理可能促进内源性大麻素的合成。
　　因此,我们推测:(1)异氟醚预处理可以上调脑组织CB1受体的表达;(2)CB1受体可能参与了异氟醚预处理诱导的脑缺血耐受。
　　目的:以大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型为基础,探讨CB1受体在异氟醚预处理神经保护中的作用。
　　方法:(1)SpragueDawley(SD)大鼠随机分为对照组和异氟醚预处理组,通过免疫荧光染色法和Westernblot方法检测两组动物脑组织中CB1的分泌和和表达变化情况;检测MCAO2h再灌24h后两组脑梗死容积和神经行为学评分。(2)48只雄性SD大鼠随机分为6组:假手术组:仅暴露颈总动脉,不结扎血管;单纯缺血组:阻塞大鼠大脑中动脉2h;异氟醚预处理组:大鼠吸入异氟醚(1.5%)1h/d,连续5d;溶剂+异氟醚预处理组和CB1受体拮抗剂+异氟醚预处理组:每日在吸入异氟醚前30min分别给予溶剂3mL/kg(i.p.)和AM2511mg/kg(i.p.),连续5d;CB1受体拮抗剂+单纯缺血组:每日腹腔注射(i.p.)AM2511mg/kg,连续5d。除假手术组外其余各组均在最后一次预处理24h后行颈内动脉线栓法致大脑中动脉阻塞(2h)模型,观察再灌注后24h神经行为学评分,然后取大脑行2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染色以计算脑梗死容积百分比。
　　结果:(1)Westernblot检测结果显示,与对照组相比,异氟醚预处理组大鼠海马组织CB1受体表达量明显升高(P<0.05);MCAO后异氟醚预处理组神经行为学评分明显高于对照组,异氟醚预处理组脑梗死容积显著小于对照组。(2)假手术组神经行为学正常且未见梗死灶;异氟醚预处理组和溶剂+异氟醚组预处理组脑梗死体积百分比明显小于对照组、拮抗剂组和拮抗剂+异氟醚预处理组(P<0.05);神经行为学评分异氟醚预处理组和溶剂+异氟醚预处理组明显高于对照组、拮抗剂组和拮抗剂+异氟醚预处理组(P<0.05);而拮抗剂组、拮抗剂+异氟醚预处理组与对照组之间神经行为学评分和脑梗死体积百分比均无统计学意义。
　　结论:通过对大鼠连续5d异氟醚的吸入,可以显著提高脑组织中CB1受体的表达量;MCAO后,异氟醚预处理可以减少脑梗死容积,提高神经功能学评分,而这种保护作用被AM251所逆转。CB1可能参与了异氟醚预处理诱导的脑缺血耐受。

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文献回顾

1 脑缺血再灌注损伤的机制

1.1 炎症反应与脑缺血再灌注损伤

1.2 谷氨酸与脑缺血再灌注损伤

1.3 Ca2+失调与脑缺血再灌注损伤

1.4 自由基与脑缺血再灌注损伤

1.5 细胞死亡

2 异氟醚预处理与脑保护

2.1 异氟醚预处理的研究现状

2.2 异氟醚预处理脑保护作用的可能机制

3 内源性大麻素系统与神经保护作用

3.1 内源性大麻素

3.2 大麻素受体

3.3 内源性大麻素的合成和降解酶系统

3.4 内源性大麻素的神经保护作用及可能机制

正文

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要器材

1.3 主要试剂AM251

1.4 主要实验试剂配制

2 方法

2.1 实验方案

2.2 异氟醚预处理方式

2.3 局灶性脑缺血再灌注模型制备

2.4 免疫荧光染色

2.5 Western Blot

2.6 神经行为学评分和 TTC 染色

2.7 TUNEL 染色

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 异氟醚预处理对大鼠脑梗死容积和神经功能的影响

3.2 异氟醚预处理后大鼠脑组织 CB1 受体的表达变化

3.3 腹腔注射 AM251 后对异氟醚预处理诱导的脑保护作用的影响

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢